來自Genomeweb的消息，加拿大公共的研究人員利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)血斑中艾滋病病毒基因進(jìn)行測(cè)序，低成本地檢測(cè)HIV病毒抗藥性。此方法比基于PCR的對(duì)血漿樣品進(jìn)行基因分型的成本更低，還可以更全面地了解艾滋病毒抗藥性信息。

一項(xiàng)發(fā)表于Antiviral Therapy雜志的初步研究中，加拿大國家艾滋病病毒及反轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)驗(yàn)室利用羅氏454 GS FLX系統(tǒng)對(duì)48位感染HIV-1病毒病人的血斑進(jìn)行測(cè)序，研究病毒的抗藥性。這些樣本來自在2007年進(jìn)行的一項(xiàng)研究，這些病人被診斷感染HIV-1，但尚未接受任何治療。

這次研究主要是為了確定是否能夠利用二代測(cè)序技術(shù)從已經(jīng)干燥的血斑中，鑒定抗藥性病毒株，并且降低其檢測(cè)成本。實(shí)驗(yàn)中使用GS FLX系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果與Sanger方法進(jìn)行比較。研究人員將樣本進(jìn)行序列標(biāo)記并混合后在GS FLX上測(cè)序，獲得3個(gè)相互重疊的擴(kuò)增子序列，覆蓋了整個(gè)HIV-1 PR基因以及RT基因的前237個(gè)編碼子。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，454測(cè)序結(jié)果與Sanger方法相符，甚至檢測(cè)到一個(gè)Sanger法沒有檢測(cè)到的突變。文章的作者說道：“混合樣本的454焦磷酸測(cè)序是一個(gè)非常有效而經(jīng)濟(jì)的二代測(cè)序方法，尤其應(yīng)用于干血斑的HIV病毒抗藥性發(fā)生率鑒定。這一方法有助于在有限的資源及配置下，低成本高通量地獲得HIV病毒抗藥性數(shù)據(jù)。”

加拿大HIV遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任James Brooks認(rèn)為將血斑用于檢測(cè)相比血液有諸多優(yōu)勢(shì)，比如更容易進(jìn)行收集儲(chǔ)存。收集血液樣本需要*，針頭，符合標(biāo)準(zhǔn)診所設(shè)置并從血液中分離細(xì)胞成分。而血斑只需要抽取很少的血液，在紙上進(jìn)行干燥保存。除此之外，血液需要保存在零下八十度，這一條件對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)室是一個(gè)挑戰(zhàn)，而血斑可更簡(jiǎn)單而長(zhǎng)期的保存。

同時(shí)，他表示這次基因分型的實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)未接受治療的艾滋病患者的血液和血斑的檢測(cè)結(jié)果有很好的一致性，為下一步尋找低成本的病毒抗藥性篩選方法奠定了基礎(chǔ)。這一技術(shù)有望將原有實(shí)驗(yàn)基因分型價(jià)格和商業(yè)測(cè)試價(jià)格分別降低40%和90%。

Brooks說，“雖然454的測(cè)序技術(shù)相對(duì)于其他二代測(cè)序系統(tǒng)價(jià)格略高，但是454的長(zhǎng)度長(zhǎng)特點(diǎn)非常適合我們所關(guān)注的HIV基因組的區(qū)段。而Ion Torrent的技術(shù)也有一定的特長(zhǎng)，但是目前它的讀長(zhǎng)還不夠長(zhǎng)。所以這次454成為了贏家。”

歡迎索取454測(cè)序儀的資料

除了更加便宜之外，比起傳統(tǒng)方法二代測(cè)序方法可以更靈敏的發(fā)現(xiàn)變異基因。在初步研究中，即使在出現(xiàn)頻率大于20%的變異中，454發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Sanger測(cè)序沒有發(fā)現(xiàn)的變異（其頻率約為20.4%）。如果測(cè)序深度進(jìn)一步增加，二代測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)頻率在1%的變異。研究人員下一步將決定測(cè)序深度，主要因素在于低頻率變異的臨床意義及重要性。Brooks說，“要決定測(cè)序深度并不容易，因?yàn)橛凶C據(jù)表明一些低頻率的突變也導(dǎo)致抗藥性，而低頻率突變?cè)谌巳褐谐霈F(xiàn)的幾率很小。”測(cè)序的深度也是影響檢測(cè)價(jià)格的因素之一。目前對(duì)于一些低頻率突變引起部分患者抗藥性的原因還不明確。

對(duì)于臨床來說，另外一個(gè)關(guān)鍵步驟是如何自動(dòng)化這項(xiàng)檢測(cè)。從樣本制備到生物信息流程的建立，實(shí)驗(yàn)小組正與加拿大微生物實(shí)驗(yàn)室合作開發(fā)相關(guān)軟件。此外，對(duì)于已接受治療的患者，采取血斑是否合理還需進(jìn)一步論證，因?yàn)樵诮邮苤委熤笏杉难咧械牟《竞脱褐械牟《究赡懿煌?/font>

實(shí)驗(yàn)室的zui終目標(biāo)是建立一個(gè)從焦磷酸測(cè)序到直接產(chǎn)生抗藥性報(bào)告的一體化檢測(cè)方案。這一技術(shù)將推廣到加拿大以外的其他國家。比如世界衛(wèi)生組織HIV病毒抗藥性實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中的其他實(shí)驗(yàn)室。Brooks所在的實(shí)驗(yàn)室也接受來自其他國家的樣本，通常是一些中低收入國家，實(shí)驗(yàn)室贊助所有的檢測(cè)費(fèi)用，一旦實(shí)驗(yàn)成本可以有效降低，那么就可以提高更多的服務(wù)。

除此之外，這一技術(shù)也有望推廣到其他疾病比如肝炎。目前加拿大已經(jīng)著手用該方法對(duì)于丙肝病人的血斑中的病毒進(jìn)行分型，以監(jiān)測(cè)丙型肝炎的發(fā)展趨勢(shì)，這一技術(shù)無疑對(duì)于降低基因分型成本有極大幫助。

關(guān)于454
454是*家新一代測(cè)序技術(shù)的*，基于焦磷酸測(cè)序的基本原理，將其優(yōu)化為迄今為止可達(dá)1Kbp單一序列讀長(zhǎng)的測(cè)序平臺(tái)，以其長(zhǎng)序列讀長(zhǎng)測(cè)序保持著在領(lǐng)域內(nèi)無法替代的應(yīng)用地位；2007年位于美國Branford 的454公司被羅氏收購，整合至羅氏診斷應(yīng)用科學(xué)部，成為其zui重要的產(chǎn)品線之一，為探索新一代測(cè)序技術(shù)在人類健康事業(yè)中的應(yīng)用而奮力前行。