1.1

藍靛果

 [Lonicera edulis Turcz.]別名藍靛果忍冬、藍果忍冬、藍果，俗稱山茄子、羊奶子、黑瞎子果，為忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木，果實為藍色小漿果，具有很高的食用與保健價值。

1.2

植物組織培養

在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞或原生質體等，培養在人工培養基和人工控制的環境中，使其再生新植株的過程和技術。（GB/T 16620）

1.3

外植體

用于植物組織培養的離體植物器官、組織、細胞以及原生質體等。

1.4

培養基

根據植物營養原理與植物組織培養的要求人工配制的營養基質。

1.5

培養基母液

按試劑種類和性質分別配制的高于培養基配方濃度的溶液。

1.6

植物生長物質

調節植物生長發育的物質，包括植物激素和植物生長調節劑。常用的植物生長物質有生長素類似物IBA（吲哚丁酸）、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、KT（激動素）等。

1.7

外植體滅菌

將外植體表面的微生物*殺死并盡可能少傷害外植體組織和表層細胞的過程。

1.8

接種

將滅菌后的外植體在無菌條件下接入培養容器內的培養基中的過程。

1.9

誘導培養

將滅菌后的外植體接種到誘導愈傷組織等器官培養基中進行培養的過程。

1.10

繼代培養

培養過程中將培養材料周期性地分株、分割等操作后，轉接入新鮮培養基中繼續培養的過程。

1.11

生根培養

將不定芽轉移到生根誘導培養基中誘導生根，生成完整植株的過程。

1.12

移栽

組培苗在培養瓶中長出一定數量的根或根原基后，從瓶中取出移植到基質中的過程。

2　實驗設備

2.1

滅菌設備

高壓蒸汽滅菌鍋、紫外燈。

2.2

接種設備

超凈工作臺、槍式鑷子、眼科用解剖剪、*、酒精燈等。

2.3

培養設備

培養容器瓶（罐頭瓶）、培養架、空調、照明燈管。

2.4

實驗設備

電子天平（0.01mg）、冰箱、pH 5.0～7.0精密試紙、酸度計、溫濕度表、照度計、燒杯、試劑瓶、量筒、容量瓶、移液槍等。

3　環境設備消毒滅菌

3.1

接種室消毒滅菌

接種前用紫外燈照射30min，每周用*及甲醛混合薰蒸。

3.2

培養室消毒滅菌

每周用*及甲醛混合薰蒸。 

3.3

超凈工作臺的消毒滅菌

接種前用紫外燈照射30min，并用70％酒精擦拭臺面，定期清洗超凈工作臺過濾膜。

3.4

接種器具的消毒滅菌

使用前將槍式鑷子、解剖剪、培養皿、*進行高溫蒸汽消毒；接種過程中采用酒精燈灼燒消毒。

4　組培育苗

4.1

培養基制備

4.1.1

母液配制及保存

選用化學純或分析純的化學藥品，根據MS培養基配方，分別配制大量元素（50倍）、微量元素（100倍）、鐵鹽（200倍）、有機物（100倍）、植物生長調節物質（0.1～0.5mg/mL）幾種化合物的母液（見附件A.1和附件A.2），將母液保存在4℃的冰箱里。

4.1.2

培養基配制

根據培養基配方需求，每升培養基中分別加入瓊脂粉（6.5g）、蔗糖（30g）和各類母液，依次溶解于蒸餾水，定容后用0.1mol/L HCl或0.1mol/L lNaOH溶液調節pH=5.8，定量分裝至培養瓶中并封口，制備成培養基，備用。培養基配制流程見下圖。

圖

4.2

培養基滅菌

瓶裝培養基在10h內完成滅菌，滅菌方式采用高壓蒸汽滅菌，在壓力0.105MPa、溫度121℃條件下滅菌20min～30min。鍋內的滅菌物以不超過鍋的容量3/4為宜，高壓滅菌時鍋內使用蒸餾水。

4.3

培養基保存

滅菌后的培養基放入接種室，常溫條件下7d內使用，2℃～4℃條件下14d內使用。培養基應保存于潔凈環境中，注意避光和防塵。

4.4

外植體接種

4.4.1

外植體的選擇

選擇生長健康、強壯的植株作為采樣母株，剪取母樹下部的半木質化的莖段作為外植體，采樣時間宜選擇晴天或露水干后采集。

4.4.2

外植體滅菌

先將外植體用洗滌劑作表面清洗，清除表面的塵土，再將外植體用流水沖洗30min后，將外植體放入消毒瓶中。把裝有外植體的消毒瓶放入超凈工作臺，在超凈工作臺上打開裝有外植體的消毒瓶，倒入70%酒精并搖晃消毒瓶，浸泡消毒10s，倒去酒精，用無菌水沖洗外植體3次～5次；然后用0.1% HgCl2浸泡8min，無菌水沖洗3次～5次，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

4.4.3

外植體切割

將表面消毒后的外植體切割，接入培養基中。莖在接種前用*刀剪去兩端，長1.0 cm～2.0cm。

4.4.4

外植體接種

操作時，先將培養瓶的封口膜輕輕取下，放在一邊，將培養瓶口在酒精燈外焰上旋轉灼燒消毒，殺死瓶口的微生物。將槍式鑷子在酒精燈上灼燒消毒并冷卻后，將外植體接種到培養基中，每個培養瓶放3個外植體，接種后蓋上封口膜，并標注日期。

4.5

組培苗培養條件

培養室的溫度控制在25℃±3℃，相對空氣濕度控制在70%～80%，光照強度為27μmol?m-2?s-1～36μmol?m-2?s-1，光照時間為12h/d。

4.5.1

誘導培養

將外植體接種到誘導培養基中，誘導培養基選用：MS基本培養基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培養20d～25d后進行繼代增殖培養。

4.5.2

繼代增殖培養

外植體經誘導培養生成愈傷組織或叢生芽，轉接至增殖培養基中繼代培養，繼代增殖培養基可選用：MS基本培養基+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+KT 1.0 mg/L，培養30-35d。

4.5.3

生根培養

選取培養瓶中長度1.5cm～3.0cm生長健壯的芽接種至生根培養基中，生根培養基可選用：1/2MS基本培養基+NAA 0.5mg/L+IBA 1.0mg/L。培養25d～35d,組培苗生長過程中在基部會出現白色嫩根，25d后平均生根數3條以上，根長約在1.0cm～4.0cm。

4.6

煉苗

4.6.1

煉苗標準

當組培幼苗基部長出3條以上長1.0cm～4.0cm的新根、苗高3～8cm，即可進行煉苗處理。

4.6.2

組培苗馴化

將裝組培苗的培養瓶從培養架上輕輕取下，迅速轉移到日光溫室中，自然散射光下煉苗，溫度控制在20℃～25℃，每天中午在培養瓶周圍噴灑霧水，以保濕降溫，封口煉苗1d～2d。

4.6.3

開瓶鍛煉

封口煉苗后打開瓶口，向瓶內注入超過培養基表面0.5cm高的自來水，溫度控制在20℃～25℃，

2d～4d后即可移栽。

4.6.4

組培苗質量與分級

按照株高高矮分級，分2級，即苗高≦5cm和﹥5cm。

4.7

移栽苗

用手指或鑷子輕輕取出組培苗，用清水洗去苗基部的培養基，移栽至裝有黑壤土、草碳土和細河沙（混合比例為2：1：1）的混合基質的育苗盤中，育苗基質中按每立方米基質加入1kg磷酸二氫銨。育苗盤規格為35cm×50cm，育苗盤四壁高度不能低于7cm，育苗基質放入育苗容器并澆透水后，厚度應不小于5cm。

4.8

移栽苗管理

育苗期保持育苗基質見干見濕，育苗水分管理按照GB/T 6001進行。溫室空氣濕度應保持70%～80%，溫度應在18℃～25℃。

4.9

病蟲害管理

藍靛果苗期病害主要為立枯病。主要防治方法：育苗前使用0.05%炭疽福美作藥土防治，或50%多菌靈、70%甲基硫菌靈等作藥土防治，每平方米用藥8～9克；幼苗發病前期噴藥防治，選用70%土菌消（惡霉靈）可濕性粉1000倍液，或70%甲基硫菌靈可濕性粉劑800倍液，隔周噴施，共噴兩次。

蟲害主要是螞蟻。防治方法：應在育苗床周邊撒一圈百蟲靈等驅蟻藥。

生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未經蒸煮的淀粉顆粒的酶，可能包括α-*、β*、葡萄糖*、普魯蘭酶。它可以將淀粉傳統工藝中的糊化、液化和糖化合并為一步直接進行糖化，如果將其應用于無蒸煮的酒精發酵，可節約總能耗的30%~40%。已發現的能產生*的微生物種類較多，報道zui多的是黑曲霉、根霉和芽孢桿菌。本文篩選出能產生*的細菌，對其進行初步鑒定，并進行了酶學性質的研究。

1   材料與方法

1.1  土樣

     校內食堂垃圾附近的土壤。

1.2  培養基

     平板分離培養基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在65℃下無菌操作加入。

液體發酵培養基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在常溫下無菌操作加入。

1.3 菌種篩選方法

    初篩：變色圈法，選擇圈徑比較大的菌落，進一步劃線分離后，進行產酶測定。

    復篩：測酶活，選擇酶活高的菌株作為目的菌株。

1.4 生*活的測定方法

    酶活力測定方法：將發酵液在4℃，8000r/min下，離心30min后取出上清液，再通過抽濾得到的濾液為粗酶液，取1ml粗酶液，加入到19mLpH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，再加入0.5g的可溶性淀粉為底物，30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液終止反應，反應液在4000r/min下離心5min，用DNS法測定上清液中還原糖的含量，測定540nm處的吸光度（在酶活測定體系中，以純水取代粗酶液作為空白），查葡萄糖標準曲線得到水解產物中的葡萄糖量，從而確定生*的酶活力大小。

酶活力定義：在pH6.5、溫度為30℃保溫120min條件下，1min產生1ug葡萄糖所需要的酶的量規定為1個酶活力單位（U）。

1.5 菌種鑒定

   進行形態和生理生化檢測。

1.6 生淀粉糖化酶的酶學性質研究

1.6.1 酶的熱穩定性研究 取一定量的粗酶液，分別在50℃、60℃、70℃和80℃不同溫度下保溫60min，每隔10min測定殘留酶活力。

1.6.3 pH的影響  配制pH分別為3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的檸檬酸鹽緩沖液，在不同pH緩沖液中讓酶水解生淀粉，通過水解產物中葡萄糖的量計算酶活力的大小。

1.6.4 酶的pH穩定性研究  將酶溶于pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，分別放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后，測定殘余物的酶活力大小。

1.6.5 金屬離子的影響  以不加金屬離子為對照，分別在反應液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，測定酶活。

2  結果與分析

2.1 菌種篩選

    從初篩平板上挑出了8株有較大淀粉水解圈的菌株，分別編號為QD001到QD008。測得它們各自的圈徑比見表1，對圈徑比較大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通過搖瓶復篩，得到QD006酶活力zui高，達到10、18U/ml，確定為目標菌株。

2.2  菌種鑒定

     QD006的菌落較小，較薄，較透明且“細膩"，邊緣光滑，革蘭氏染色確定該菌為革蘭氏陽性菌，經顯微觀察呈球形，為球菌；糖類發酵試驗顯示改菌能利用葡萄糖，蔗糖，但不能利用乳糖：VP試驗為陰性；MR試驗為陰性；吲哚試驗為陰性；檸檬酸鹽為陰性。初步鑒定該菌為Staphylococcus intermedius。

2.3生淀粉糖化酶的酶學性質

2.3.1 溫度對酶活的影響

   由圖1可知，酶的zui適作用溫度為50℃。當溫度小于50℃時，反應速率隨溫度升高而升高，但高于zui適溫度，酶的反應速率下降。

2.3.2 生淀粉糖化酶的熱穩定性

    由圖2可知，該生淀粉糖化酶在50℃和60℃時，放置1h后，殘余酶活分別是99.8%和98.2%，由此可知，在60℃內，該生淀粉糖化酶具有很好的熱穩定性。

2.3.3 pH對酶活力的影響

    由圖3可知，該酶的zui適為6.5左右，同時可以看出pH在3-4.5的范圍內，生淀粉糖化酶的酶活變化不大，上升趨勢比較小，但pH對生淀粉糖化酶的影響呈現出明顯的鐘罩形。

2.3.4 酶的耐酸穩定性

    由圖4可知，該生淀粉糖化酶在pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中放置1、2、5h后，殘余的酶活力都在70%以上，隨著放置時間的延長，酶活力迅速降低，放置60h，殘余的酶活力僅在10%左右，所以該酶的耐酸穩定性比較弱。

2.3.5 金屬離子對生淀粉糖化酶的酶活力的影響

由表2可知，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。

3  結論

   從自然界分離得到產生*的菌株QD006，通過形態和生理生化鑒定，初步確定為Staphylococcus intermedius，經對該酶酶學性質的研究，其zui適溫度為50℃，zui適pH為6.5，并且具有良好的熱穩定性，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，Fe3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。