平板計(jì)數(shù)瓊酯(Plate Count Agar，PCA)是用來檢測飲用水中異養(yǎng)菌(Heterotrophic Plate Count，HPC)的常用培養(yǎng)基，其營養(yǎng)含量高，歷*應(yīng)用zui廣泛。但從2O世紀(jì)7O年代末開始，越來越多的檢測證實(shí)，采用PCA 將明顯低估了異養(yǎng)菌的真實(shí)數(shù)量，根據(jù)PCA計(jì)數(shù)結(jié)果來評(píng)價(jià)水處理的有效性及管網(wǎng)的清潔、衛(wèi)生程度并不可靠，飲用水的致病風(fēng)險(xiǎn)很可能較預(yù)期高得多。提高檢測技術(shù)的靈敏度，獲得盡可能高的計(jì)數(shù)仍應(yīng)視為飲用水微生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。

1 HPC結(jié)果偏低的原因分析

   PCA等培養(yǎng)基可能只檢出了水樣細(xì)菌總數(shù)中很少的一部分，其他未檢出細(xì)菌根本就不能在檢測環(huán)境中生長，或者生長相對(duì)緩慢，在設(shè)定時(shí)間內(nèi)不能形成可見菌落。

1．1 細(xì)菌存活但不能被檢出

   弧菌(Vibrio)、埃希氏菌(Eschericha)、沙門氏菌(Salmonella)、氣單胞菌(Aeromonas)、彎曲桿菌(Campylobacter)、志賀氏菌(Shigella)等都被證實(shí)存在具有生命活性但不能被培養(yǎng)檢出。在培養(yǎng)基平板上，這些細(xì)菌不能形成可見菌落，但存活直接培養(yǎng)表明它們具有代謝活力。顯而易見，常規(guī)檢測技術(shù)遺漏了這些細(xì)菌，造成結(jié)果報(bào)告偏低。這也可用來解釋發(fā)生軍團(tuán)菌流行病時(shí)，往往不能從水樣中檢出侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)等致病菌的現(xiàn)象。

1．2 培養(yǎng)基的選擇性

   由于細(xì)菌生理、生化特征的多樣性、沒有哪種培養(yǎng)基可將水樣中的存活細(xì)菌全部檢出，每種培養(yǎng)基都趨向于只計(jì)數(shù)適應(yīng)該種營養(yǎng)條件的一類細(xì)菌。如果某種培養(yǎng)基的選擇性弱，則其可檢出更大量的細(xì)菌。

   用目前可利用的幾種培養(yǎng)基檢測相同水樣，計(jì)數(shù)結(jié)果往往有顯著差異，表明這些培養(yǎng)基都具有較強(qiáng)的選擇性。此外，由于對(duì)出廠水或管網(wǎng)水進(jìn)行了消毒處理，只有少數(shù)優(yōu)勢種才能存活、繁殖，培養(yǎng)基選擇對(duì)其能否被檢出影響相當(dāng)大，有的培養(yǎng)基可能根本就不支持這些優(yōu)勢種的生長，有的則比較正常。

1．3 培養(yǎng)方法的固有缺陷

   用傾倒平皿檢測法，培養(yǎng)基平板上生長起來的菌落可能起源于單個(gè)或多個(gè)細(xì)菌。如果是多個(gè)細(xì)菌團(tuán)聚在一起，或者多個(gè)細(xì)菌同時(shí)粘附到某個(gè)無機(jī)或有機(jī)顆粒物表面，而水樣前處理，主要是人工或機(jī)械混勻，不能使團(tuán)聚或粘附細(xì)菌彼此分離，則zui終只能形成一個(gè)菌落，必然導(dǎo)致對(duì)總數(shù)量的低估。

1．4 細(xì)菌的脅迫受損與再生長

   消毒不充分或樣水保存不當(dāng)都可能使細(xì)菌處于亞致死的受損狀態(tài)。這些結(jié)構(gòu)或代謝受損的細(xì)菌不能在含有表面活性劑的選擇性培養(yǎng)基上生長并形成菌落。然而，進(jìn)入管網(wǎng)后，受損細(xì)菌可能完成恢復(fù)性生長，以致管網(wǎng)末梢水中細(xì)菌的檢出量高于出廠水。由于表面的物理保護(hù)作用，顆粒物，包括顆粒活性碳(GAC)，往往成為受損菌的重要載體n]。種源

菌在管網(wǎng)內(nèi)繁殖再生長，帶來的不利影響包括：(1)產(chǎn)生異臭異味；(2)微生物腐蝕管道內(nèi)壁；(3)干擾對(duì)大腸菌的檢測；(4)消毒劑殘余量低或失效期間的健康風(fēng)險(xiǎn)，如假單胞菌(Pseudomones)、莫拉氏菌(Moraxella)或黃桿菌(Flavobacterium)等的致病作用。環(huán)境溫度、水中可生物降解有機(jī)物的含量、水流速度、水體濁度、管網(wǎng)中消毒劑殘余量等控制受損菌的再生長程度。

   傾倒平皿檢測法使細(xì)菌遭受熱沖擊，受損菌可能不能在檢測期內(nèi)修復(fù)生長，導(dǎo)致少計(jì)。

   有機(jī)物組成廣泛但含量低的培養(yǎng)基有利于受損菌修復(fù)生長。為更真實(shí)地檢出水中細(xì)菌的數(shù)量，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基組成是必要的。

2 提高HPC計(jì)數(shù)結(jié)果的途徑

   使用PCA培養(yǎng)基，用傾倒法檢測水中細(xì)菌總數(shù)的技術(shù)穩(wěn)定，但由于PCA具有選擇性，而且不能檢出產(chǎn)色素菌，因此降低了反映真實(shí)結(jié)果的價(jià)值，需要改進(jìn)現(xiàn)行方法，提高檢測靈敏度。

2．1 直接計(jì)數(shù)法

2．1．1 掃描電鏡觀察計(jì)數(shù)

   用掃描電鏡計(jì)數(shù)水生細(xì)菌是有效的l2]，其技術(shù)關(guān)鍵有2點(diǎn)：(1)要能將水樣中的細(xì)菌全部分離出來；(2)具備區(qū)分細(xì)菌與非細(xì)菌成分的熟練技術(shù)。

2．1．2 熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)

   熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)法快捷，從取樣到檢出只要20—30分鐘，而且靈敏性好。操作程序是先固定水樣，然后用化學(xué)熒光物染色，再真空過濾到不產(chǎn)生熒光的聚碳酸酯膜上，zui后在熒光顯微鏡下觀察。吖啶橙色染料(Acridine Orange，AO)是常用染色物質(zhì)，能與RNA和DNA反應(yīng)而產(chǎn)生熒光。與其他直接計(jì)數(shù)技術(shù)一樣，熒光顯微鏡觀察法不能區(qū)分細(xì)菌種類，分析代謝活性或判斷是否處于存活狀態(tài)。如果由于工作經(jīng)驗(yàn)不足，將死亡細(xì)菌、碎屑物混計(jì)在內(nèi)，則會(huì)過高估計(jì)活細(xì)菌總數(shù)。有些研究將AO染色與測代謝活性的方法結(jié)合起來，如A()-INT[3]，提高了檢測準(zhǔn)確性。

直接計(jì)數(shù)法獲得的結(jié)果往往較標(biāo)準(zhǔn)平板法高出2個(gè)甚至更多個(gè)數(shù)量級(jí)。

2．2 改進(jìn)接種方法

   傾倒平板法雖然簡單，但缺點(diǎn)也非常明顯：(1)盡管要求將培養(yǎng)基的傾倒溫度控制在45—46~C，然而熱沖擊依然存在；(2)平板表層以下的菌落生長慢，而且不便于轉(zhuǎn)種培養(yǎng)；(3)水樣體積的限制（＜2ml）

   實(shí)踐表明下述兩種接種方法的應(yīng)用效果良好。

2．2．1 均勻涂布接種

   首先是制備具有吸附能力的干燥培養(yǎng)基。將15mL已滅菌培養(yǎng)基倒入lOOmm×15mm 或90mm×15mm平皿中，翻轉(zhuǎn)，42℃恒溫固化24 h，使水分喪失2～3g后立即使用，或用塑料袋封好在4C儲(chǔ)存，有效期不應(yīng)超過2周。如果需要當(dāng)日制備并使用，則將25mL培養(yǎng)基倒入平皿中，不加蓋，室溫(24～ 26℃)下在層流通風(fēng)柜內(nèi)干燥，同樣使水分喪失2-3g。

   將0．1～0．5mL水樣均勻涂布到培養(yǎng)基表面的方法有兩種：(1)使用長200mm，直徑4mm，一端45。彎曲的玻璃棒，人工將樣水推開；(2)使用轉(zhuǎn)臺(tái)，將平皿固定在轉(zhuǎn)臺(tái)上，啟動(dòng)旋轉(zhuǎn)，前后擺動(dòng)移液管(止于距邊緣0．5cm處)，將水樣緩慢釋放出來。不論采用何種方法，都要保證水樣被*吸收。均勻涂布接種法獲得的結(jié)果總是不同程度地高出傾倒平皿法。尤其計(jì)數(shù)海洋細(xì)菌時(shí)，均勻涂布的平均計(jì)數(shù)幾乎為傾倒法的3倍。

2．2．2 濾膜計(jì)數(shù)法

   由Taylor和Geldreich提出了用濾膜計(jì)數(shù)水中細(xì)菌總數(shù)的方法l4]，使用培養(yǎng)基命名為rn—sPC，已商業(yè)化生產(chǎn)，可在市場上購買到。濾膜法的優(yōu)勢在于可檢測大量低濁度水樣，尤其適合分析潔凈水(< 1-10CFU／mL)。事實(shí)上，如果將水樣量由lOOmL增至300mL，細(xì)菌的檢出率明顯增加。在對(duì)722個(gè)水樣的檢測中，若只取1OOmL水樣，則有259例不能檢出，但將水樣量增至300mL，則其中32 的水樣有細(xì)菌有檢出。

   在大多數(shù)情況下，濾膜法獲得的計(jì)數(shù)結(jié)果高于傾倒平皿法。此外，產(chǎn)色素菌在濾膜上生長速度快，而且易挑出單菌落進(jìn)行種類鑒定及生化分析。但是，濾膜法檢測可能受濾膜質(zhì)量等因素影響。

2．3 調(diào)整培養(yǎng)溫度和時(shí)間

   出于腸道衛(wèi)生學(xué)考慮，歷*將培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的環(huán)境溫度控制在37℃ ，后來確定為35℃ 培養(yǎng)48h。大量對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，35℃ 肯定是zui不適宜獲得zui高菌落數(shù)的溫度，計(jì)數(shù)結(jié)果不及28℃ 時(shí)的14％ ，20℃時(shí)的20 。鑒于細(xì)菌總數(shù)用作評(píng)價(jià)凈水效率的價(jià)值高于其衛(wèi)生學(xué)意義，很多學(xué)者贊同降低培養(yǎng)溫度(20℃或28℃)，延長培養(yǎng)時(shí)間(5～7d)，以此促使zui大數(shù)量的菌落出現(xiàn)在計(jì)數(shù)平板或?yàn)V膜上。細(xì)菌總數(shù)會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加。一般情況下，12～14d可達(dá)到zui高計(jì)數(shù)，而在前6天，增長速率zui快。對(duì)平板計(jì)數(shù)技術(shù)，zui快增長發(fā)生在前2～4d。溫度越高，達(dá)到50 zui高菌落數(shù)所需時(shí)間越短。如以12～ 14dzui高值為標(biāo)準(zhǔn)，則達(dá)到5O 數(shù)量，35℃ 需4d，28℃ 需6d，20℃ 需8d。長期培養(yǎng)不適合開展常規(guī)檢測。建議在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成計(jì)數(shù)，必要情況下，將已計(jì)數(shù)平板繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察，記錄zui大值。

2。4 選用替代培養(yǎng)基

   目前可利用的替代培養(yǎng)基有高、低營養(yǎng)成分兩大類。高營養(yǎng)成分培養(yǎng)基有m—SPC培養(yǎng)基；低營養(yǎng)成分培養(yǎng)基有NWR1瓊酯、R2A 培養(yǎng)基、CPS培養(yǎng)基、DP瓊脂培養(yǎng)基，Henrici改良培養(yǎng)基等。

3 R2A培養(yǎng)基及其應(yīng)用

3．1 R2A培養(yǎng)基的應(yīng)用

   R2A培養(yǎng)基可用于傾倒平板、均勻涂布和濾膜檢測法。由于R2A培養(yǎng)基能促進(jìn)受損細(xì)菌的恢復(fù)性再生長，其在20℃ 下培養(yǎng)7d獲得的zui高菌落數(shù)總是高于PCA和m—SPC(表1)。從表中還可看出，R2A均勻涂布法計(jì)數(shù)結(jié)果更高。相對(duì)于PCA，細(xì)菌在R2A 培養(yǎng)基上的生長速度要慢，形成的菌落要小，在48h內(nèi)，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)困難，因而需要延長培養(yǎng)時(shí)間，使菌落生長得足夠大，但不會(huì)或少融合生長。

   R2A培養(yǎng)基適合產(chǎn)色素菌生長。在3～5d內(nèi)，產(chǎn)色素菌可形成明顯的菌落。均勻涂布法計(jì)數(shù)產(chǎn)色素菌所獲得的結(jié)果比較理想。耐氯菌在R2A 培養(yǎng)基上生長良好。28℃ 培養(yǎng)5～7d后，生長緩慢的耐氯菌菌落開始出現(xiàn)，其對(duì)1．Omg／L的游離余氯的抵抗力很強(qiáng)。將PCA 上生長的菌落挑出，轉(zhuǎn)培養(yǎng)到新配PCA上，則有很多不能再生長。但如果將丙酮酸鈉以外的R2A其他組成成分雙倍配制，則新的培養(yǎng)基適合分離菌株的轉(zhuǎn)培養(yǎng)，從而有利于進(jìn)行種類鑒定和生化特征研究。

R2A培養(yǎng)基已成功地用來檢測飲用水樣、GAC、管道內(nèi)壁生物膜、污損反滲透膜內(nèi)異養(yǎng)菌的數(shù)量，在可比培養(yǎng)條件下，R2A 計(jì)數(shù)結(jié)果總是zui高的，但也不排除由于地理區(qū)域差異，水中細(xì)菌種群不同，R2A培養(yǎng)基上生成菌落數(shù)反而減少的情況。

4 提高飲用水中細(xì)菌檢出率的技術(shù)細(xì)節(jié)考慮

   細(xì)菌總數(shù)是評(píng)價(jià)飲用水水質(zhì)的常規(guī)檢測項(xiàng)目，一些技術(shù)細(xì)節(jié)的規(guī)范化處理或改進(jìn)有助于提高計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)程操作，本文不一一贅述。