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上海永葉生物科技有限公司

對照的重要性

時間:2013-7-22閱讀:405
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適當?shù)膶φ諏τ贗HC/ICC結(jié)果的準確闡釋至關(guān)重要。令人滿意的IHC/ICC實驗設(shè)計可產(chǎn)生結(jié)果,說明抗原位于正確的組織、細胞類型或亞細胞定位。固定、封閉、抗體孵育和抗原修復步驟的優(yōu)化將產(chǎn)生強烈而特異的信號。然而,有時實驗也會出現(xiàn)假象哦,蒙蔽了你的雙眼。因此,IHC/ICC實驗必須包含陽性和陰性對照。

此外,抗體特異性、實驗條件、組織類型之間生物學條件、甚至研究人員的差異都可能產(chǎn)生不一致的染色,導致不準確的結(jié)論。為了實現(xiàn)性能一致,詳細記錄是IHC/ICC研究的一個重要因素。在此,我們介紹了一些*的對照,可支持您IHC/ICC結(jié)果的特異性。

內(nèi)源組織背景對照

某些細胞和組織可能有著固有的生物學性質(zhì),產(chǎn)生背景染色,從而導致結(jié)果的誤讀。在一抗上樣之前,應(yīng)利用熒光(適用于熒光標記)或明視場(適用于顯色標記)照明在顯微鏡下檢查細胞和組織,以確保組織本身沒有信號。例如,脂褐質(zhì)是一種內(nèi)源的自發(fā)熒光色素,可與陽性染色混淆。

無一抗對照

將組織與抗體稀釋液孵育,其中不包含一抗的對照通常也是必需的。之后與二抗和檢測試劑孵育。只用檢測試劑染色應(yīng)該是可以忽略的,它不會掩蓋特異染色,也不會類似于特異染色的模式。

同型對照

在使用單克隆一抗時,可利用此對照。將樣品與抗體稀釋液孵育,并添加與一抗相同亞型(如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM)和濃度的非免疫球蛋白。之后將樣品與二抗和檢測試劑孵育。這些步驟將確保特異染色所出現(xiàn)的不是由免疫球蛋白分子與樣品的非特異相互作用引起的。背景染色應(yīng)該是可以忽略的,與特異染色不同。

吸附對照

體與免疫原預(yù)孵育。這會使抗體失活,組織應(yīng)該無染色或很少染色。抗原與抗體的混合物應(yīng)以10:1(摩爾比)配制,并在4 °C預(yù)孵育guoye。

隨后將預(yù)吸附的抗體與組織共同孵育,以取代一抗。將一抗產(chǎn)生的染色模式與預(yù)吸附抗體產(chǎn)生的相比較。

 


如果免疫原是肽段,那么吸附對照效果更好。不過,如果抗體是由整個蛋白產(chǎn)生的,則抗體與蛋白混合物的添加可能導致更高的非特異染色。盡管機理還不清楚,但有可能是預(yù)吸附所用的抗原本身與組織結(jié)合,產(chǎn)生非特異染色。因此,必須注意,使用整個蛋白的吸附對照不一定能驗證抗體與組織中蛋白結(jié)合的特異性。
大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的吸附對照。A. 利用anti-human phospho-MSK1親和純化過的多克隆抗體(貨號AF1036)對大鼠背根神經(jīng)節(jié)冰凍切片中的磷酸化MSK1(S212)進行染色。B. 如果抗體用S212磷酸化免疫原預(yù)先吸附,則細胞核染色(箭頭所指)不見了。

 


組織類型對照

IHC/ICC實驗的其他對照包括使用已知表達(或不表達)目的表位的組織樣品。這種策略可提供有用的參考,也可使用在初步優(yōu)化研究中。來自轉(zhuǎn)基因動物的組織特別有用,它們表達或不表達抗原。此外,不同物種的組織樣品也可包含在內(nèi),以支持抗體的物種特異性。

Western Blot有必要嗎?

人們常常開展Western blot實驗,以補充或支持IHC/ICC研究。不過,在變性過程中蛋白構(gòu)象的變化可能產(chǎn)生誤導性的結(jié)果。對于某一特定抗體,Western blot與IHC/ICC研究之間的不一致可能只是反映出實驗條件的差異。由于多克隆抗體識別多個表位,故沒那么容易產(chǎn)生這種實驗假象。
 

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