質粒提取常見問題與解析

　　　1.溶液I―溶菌液:
　　　*:它是糖苷水解酶,能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時,*作用受到抑制。
　　　葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA 受機械剪切力作用而降解。
　　　EDTA:（1）螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對DNA 的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在,有利于*的作用,因為*的反應要求有較低的離子強度的環境。
　　　2.溶液II-NaOH-SDS液:
　　　NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩定的。但當pH>12或pH<3時,就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時,該系統的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA 與質粒DNA 的變性。
　　　SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質的復合物,使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中（用RNase去除RNA 時）受到干擾。
　　　3.溶液III--3mol/L NaAc（pH4.8）溶液:
　　　NaAc的水溶液呈堿性,為了調節pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液,調回pH至中性,使變性的質粒DNA 能夠復性,并能穩定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA 、RNA 以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷,減少相斥力而互相聚合,后者是因為鈉鹽與SDS-蛋白復合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更*。
　　　4.為什么用無水乙醇沉淀DNA ?
　　　用無水乙醇沉淀DNA ,這是實驗中zui常用的沉淀DNA 的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA 很安全,因此是理想的沉淀劑。
　　　DNA 溶液是DNA 以水合狀態穩定存在,當加入乙醇時,乙醇會奪去DNA 周圍的水分子,使DNA 失水而易于聚合。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA 相混合,其乙醇的zui終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA 在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA 損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA 時可用95%乙醇代替無水乙酵,zui后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA 。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
　　　5.在用乙醇沉淀DNA 時,為什么一定要加NaAc或NaCl至zui終濃度達0.1~0.25mol/L?
　　　在pH為8左右的溶液中,DNA 分子是帶負電荷的,加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA 分子上的負電荷,減少DNA 分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA 鈉鹽沉淀,當加入的鹽溶液濃度太低時,只有部分DNA 形成DNA 鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA 沉淀不*,當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好。在沉淀的DNA 中,由于過多的鹽雜質存在,影響DNA 的酶切等反應,必須要進行洗滌或重沉淀。
　　　6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與KAc來處理?
　　　加進去的RNase本身是一種蛋白質,為了純化DNA ,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物,使沉淀更加*。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。
　　　7.為什么在保存或抽提DNA 過程中,一般采用TE緩沖液?
　　　在基因操作實驗中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA 的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa=7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍（pH）,可作DNA 的保存液,但在轉化實驗時,磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3（PO4）2沉淀;在DNA 反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA 時,大都采用Tris-HCl系統,而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA 的活性。
　　　8.如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA ?
　　　采用PEG（6000）沉淀DNA ,大小不同的DNA 分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA 分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達20%。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質粒DNA ,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其zui終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA 的分辨率大約100bp。