蛋白熱穩定性的高通量分析

      從現在開始，Applied Biosystems® 實時定量PCR系統又有了一個新用途，那就是分析蛋白的熱穩定性，包括配體-蛋白結合的高通量篩選，促進蛋白穩定性的緩沖液條件的優化，以及突變或修飾對蛋白熱穩定性的影響。這是因為，Life Technologies新推出了Protein Thermal Shift™（PTS）解決方案，它包括Protein Thermal Shift™ 試劑和軟件

      蛋白是關鍵的分子，在藥物開發的先導化合物發現過程中作為新藥靶點進行研究。藥物開發包括在多個不同分析中對數千個小分子和配體進行高通量篩選，這作為先導化合物發現項目的一部分，通常需要幾個月的時間。蛋白靶點也是一個挑戰，因為它們容易降解和聚集——需要加入無配體的蛋白穩定性篩選。除了藥物開發，科研和工業中許多利用天然蛋白的其他研究項目也采用蛋白熱穩定性篩選，這種篩選是利用蛋白熔解技術開展的。例如，在蛋白純化、結晶和功能鑒定中鑒定并使用能zui大程度穩定蛋白的配體和/或溶液（緩沖液）條件。與現有技術相比，Protein thermal shift分析技術能夠提高蛋白純化和結晶的成功率，并降低藥物開發的成本，提供了一種快速、經濟且高通量的篩選方法。在我們實時定量PCR系統上運行的Protein Thermal Shift™ 應用讓您能廉價地：

• 篩選樣品的相對蛋白熱穩定性
• 以高通量形式篩選配體與蛋白的結合

• 篩選能與您的蛋白靶點結合的小分子和片段文庫候選藥物
• 篩選能與您的蛋白靶點結合的抗體

• 在蛋白點突變后篩選樣品的穩定性變化
• 系統鑒定適當/*的緩沖液條件，以測定蛋白與配體的相互作用• 鑒定*緩沖液條件，以改善蛋白的純化和分離
• 篩選緩沖液，以鑒定出成功的結晶條件生物通

• 篩選緩沖液，以鑒定出蛋白的*儲存條件
Protein Thermal Shift™ 技術如何起作用？蛋白穩定性取決于蛋白的儲存或反應緩沖液環境中的pH、鹽含量及各種輔助因子的存在。實時熔解實驗使用蛋白結合染料（如Protein Thermal Shift™ 染料），在Applied Biosystems® 任何實時定量PCR系統（包括StepOne™、StepOnePlus™、7500、7500 Fast和ViiA™ 7系統）上運行，產生目的蛋白在某一待測緩沖液環境中特異的熒光圖像。pH、鹽含量或待測緩沖液組分的變化反映為此熒光圖像以及由此計算出的Tm（熔解溫度）的相對變化。配體與蛋白的結合對蛋白的熱穩定性也有著穩定作用，從而導致蛋白的熒光圖像呈現出可測量的差異。
Protein Thermal Shift™ 分析Protein Thermal Shift™ 試劑實現了蛋白熔解分析，這作為一個的篩選工具，可測定蛋白熱穩定性，鑒定適當的緩沖液條件，并測定蛋白-配體的相互作用。這種Protein Thermal Shift™ 分析允許系統鑒定*的緩沖液條件以及能夠穩定蛋白的配體。
Protein Thermal Shift™ 分析極易設置與運行，且整個流程一般需要0.5-2小時，這取決于所使用的系統和運行條件。我們實時定量PCR系統的可調節升降溫速率和熱準確性帶來了充分的靈活性，可實現較短的運行時間，并順應篩選流程的需求。

Protein Thermal Shift™ 分析中的步驟
• 將蛋白、緩沖液、配體（如果適用）與Protein Thermal Shift™

• 在Applied Biosystems® 實時定量PCR儀上運行熔解曲線實驗
• Protein Thermal Shift™ 染料與暴露的疏水區域結合并發出熒光
• 根據熔解曲線計算出熔解溫度（Tm）
•Protein Thermal Shift™ 軟件
Protein Thermal Shift™ 軟件可直接根據Applied Biosystems® 實時定量PCR儀器生成的文件來分析蛋白熔解的熒光讀數。不同蛋白將有著不同的thermal shift圖像，每一個都有*的熔解曲線形狀、斜率、信噪比和溫度熔解范圍。Protein Thermal Shift™ 軟件根據以下兩種方法，從這些曲線中生成一個或多個熔解溫度（Tm值）：Boltzmann派生的Tm和衍生曲線確定的Tm。Boltzmann Tm值是取自熒光熔解曲線圖的拐點（圖1，上圖），而衍生的Tm值是取自衍生曲線峰的頂部（圖1，下圖）。Boltzmann方法將自動（或手動）鑒定的熔解區域內的數據擬合成兩階段的Boltzmann模型，以生成Tm。一般來說，對于有著單個熔解區域的蛋白，可使用Boltzmann方法。然而，對于有著多個熔解區域的蛋白而言，可利用衍生方法來確定每個樣品的zui多六個Tm值。衍生方法利用原始數據的二階導數來預測溫度，其中衍生圖中可能存在zui多六個峰（局部極大值）。信噪比的經驗衍生閾值可用來確定哪個局部極大值被檢測到。
蛋白研究人員使用多種方法來研究蛋白穩定性及篩選配體，包括生物傳感器及其他高通量篩選（HTS）方法，以及較低通量的量熱儀和圓二色譜系統。這些方法能夠生成蛋白的大量細節，但要么太慢，需要大量蛋白樣品（量熱儀和圓二色譜），要么快但很貴（生物傳感器）。Protein Thermal Shift™ 技術以高通量形式滿足了快速廉價的樣品篩選需求，能夠迅速縮小候選物的數量，以便用其他技術進行更詳細的研究。Protein Thermal Shift™ 解決方案的靈活性、速度和易用性讓它成為那些需要了解蛋白穩定性在整個研究階段如何受影響的蛋白研究人員的選擇。
圖1展示了蛋白結合配體的鑒定，如圖所示，與配體結合時，蛋白的Tm增加。紅色曲線代表了蛋白溶液的重復測定，而藍色曲線代表了同一蛋白在與配體共同孵育后的重復測定。對于此樣品，Tm從~41.5ºC變化至47.5ºC，表明蛋白穩定性隨配體結合而增加。