WB成功與否的關鍵
嚴重影響WB實驗結果的關鍵點有：蛋白提取，制備凝膠，電轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，化學發光，曝光時間。基本上任何一步實驗做不好都會影響它的結果，所以很多人都說WB難做就是這個原因。

首先說說蛋白提取，找一個好的細胞裂解液是做好WBzuizui重要的一步，提不好蛋白一切都是白搭。網上有許多的配方，大家可以慢慢去試找到一個合適自己的。

然后是凝膠的配置，這個主要是要注意目的蛋白分子量的大小要和你所配置的分離膠濃度相對應，大分子量的蛋白就要配置低濃度的膠，小分子的蛋白就要配置高濃度的膠。zui后把pH值調準，不使用凝膠邊緣的孔道。PS：制膠板肯定是要洗干凈的。

電轉膜的時候，注意小分子蛋白和大分子蛋白的轉膜是有區別的（濕轉）：
大分子與小分子蛋白的轉膜
    大分子蛋白質（＞100KDa）
1.大分子蛋白跑的十分的慢，所以要確定分離膠的濃度不要大于8%，同時轉膜的時間還要適當的延長；
2.大分子蛋白質很容易在凝膠里沉淀，阻礙轉移。在轉膜緩沖液中加入SDS可以阻止大分子蛋白質沉淀，但甲醇會把SDS從蛋白質中脫離下來，所以降低轉膜緩沖液中甲醇的含量有利于大分子蛋白質的轉膜；
小分子蛋白質（＜100KDa）
1.SDS會阻礙所有的蛋白質結合到膜上，而小分子蛋白質所受到的影響會比大分子蛋白質大，所以如果目的蛋白的分子量比較小的話，要考慮把SDS從轉膜緩沖液中移除；
2.保持轉膜緩沖液中甲醇的濃度在20%左右。
除了這個還要注意轉膜的電流和時間，我是轉恒流300mA，小于100KDa的轉1.5小時以內就夠了。當然膜，膠與濾紙之間要沒有氣泡啦！

封閉，要注意時間稍微長一點會更好，多于2個小時是個不錯的建議，室溫下孵育就可以了。要注意的是做磷酸化目的蛋白的時候不能用脫脂牛奶封閉，要用BSA。

一抗孵育和二抗孵育，強烈建議使用好的抗體（特別是剛做WB實驗的同仁們）。抗體出現問題影響結果是比較少出現的。一抗孵育一般建議使用1：1000的抗體稀釋比例，室溫孵育1.5小時。二抗孵育建議使用1：6000的抗體稀釋比例，室溫孵育1.5小時。（補充一點，我配置的膠的厚度是0.75毫米的薄膠，上樣量是每個孔道20微克總蛋白）

zui后是化學發光，這個主要注意就是選一個比較好試劑就行了。

曝光時間是各人選擇合適的時間就可以了，主要是要注意所得的條帶不要顯得太粗就可以了。