科研實驗都離不開細胞的培養，細胞培養的好壞關乎實驗的zui終結果，下面我們整理了一些難養的細胞培養方法.

1）球體細胞培養：

1. 瓊脂鋪底的培養瓶：30ml無菌培養瓶，每瓶中加5ml 2%瓊脂培養基，冷卻，形成平坦底層后備用。 
2.取生長狀態良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶內，把細胞縱橫割劃成若干小區后，倒出培養液。 
3.加入0.25%的*液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養液3~5 ml，用吸管把已松動的細胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中，置溫箱繼續培養，數日后便可生長成細胞球體。 
4.換液：培養1~2日后，如需換液，微傾斜培養瓶，令培養液集于培養瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養液，再補充新培養液。 

小鼠胚胎成纖維細胞（cat.No.M7540）

2）胚胎成纖維細胞培養

用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內臟，剪成小碎塊后，用*消化法培養；如為人胚，可取皮膚培養。幼兒bao皮是培養成纖維細胞的很好對象。 

大鼠巨噬細胞（Cat.No.R1920）

3）巨噬細胞培養

1．實驗前三天，向每只大鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內）。

2．引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3．置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。

5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內。

6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養基。

7．計數細胞，每只小鼠可產生20～30×105細胞，其中90％為巨噬細胞。

8．為獲取3×105個帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

9．為純化培養細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養液置37℃ CO2溫箱中培養。

人關節軟骨細胞（Cat.No.4650）

4）軟骨細胞培養：

骨細胞內含許多細胞因子及其受體，且表明許多細胞因子通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調節軟骨細胞。目前認為促進軟骨細胞增殖和基質合成代謝的細胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，對軟骨細胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等

體外培養軟骨細胞的優點是可以大量擴增及研究其生命活動的狀況，但要維持其正常表型則 受到眾多復雜因素的調控。就其細胞因子而言，細胞因子對體外培養軟骨細胞的作用非單一的，而是一個復雜的調節作用，如生長因子的生物學活性是由受體介導的，生長因子在 軟骨細胞合成分泌后，多為無活性的前體分子需要經過特異性的激活才能發揮作用。生長因 子之間存在基因表達及其活性的相互調控TGF-β能促進PDGF的A鏈和B鏈的mRNA表達和分泌 ［30］。bFGF能促進TGF-β mRNA的表達，誘導間充質細胞分化成軟骨細胞，增強 TGF對軟骨細胞的增殖及其基質合成作用。生長因子之間還存在受體水平的調控，胰島素不 影響TGF-Ⅱ型受體的親和力但增加了Ⅱ型受體的數目引起受體上調效應，從而Ⅱ型受體與 Ⅰ型受體競爭，使胰島素與Ⅰ型受體結合減少。IL-1可使TNF受體下調，而IFN-γ卻使TNF 受體上調等。但是生長因子如何調控體外培養軟骨細胞的增殖、分化阻滯反分化或向肥 大型轉化、維持其正常軟骨細胞表型及合成特異性胞外基質還需進一步的研究。總之軟骨細 胞體外培養維持其正常表型則受到眾多因素的影響如培養條件及其方式，細胞的微環境，PH 值、細胞密度、力學變化、生長因子等等。

5）微載體細胞培養法  
1.微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養實驗，觀察細胞在一定時間內細胞的吸著率和計算細胞數，以得到zui大量細胞為佳。  
2.水化：稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無Ca2＋和Mg2＋的磷酸緩沖液（PBS），室溫下放置應不少于3小時，并不時輕微攪動，然后再用新鮮PBS洗一次。  
3. 消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用無菌的PBS漂洗一二次。 
4.傳代培養：在連續進行微載體培養時，可以不必把細胞從微載體分離下來，可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進行培養細胞能移動到新載體上。如果進行其它實驗或需要分離細胞進行傳代培養時，和常規培養相同，先用EDTA＋*溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時，需用孔徑為100微米的尼龍網或不銹鋼網過濾后，再離心濾過液，就可得到較純凈的細胞。