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準備和安裝過濾器
清洗好過濾器,干燥,放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜,用布包裝好,15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好,膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中,出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾,過濾后要檢查濾膜是否完好無損。
合成培養(yǎng)基的配制
1、根據(jù)細胞目錄中的說明,按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yǎng)基干粉,用適量超純水充分溶解。
培養(yǎng)基 | 品牌 | 貨號 |
D-MEM/F-12 | GIBCO | 12400024 |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose) | GIBCO | 12800017 |
F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder | GIBCO | 21700075 |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder | GIBCO | 12200036 |
Leibovitz's L-15 Medium powder | GIBCO | 41300039 |
McCOY's | SIGMA | M4892 |
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 11900024 |
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides and deoxyribonucleosides | GIBCO | 12000022 |
Minimum Essential Medium (MEM) powder | GIBCO | 41500034 |
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S MODIFICATION (F12K) | SIGMA | N3520 |
RPMI Medium 1640 | GIBCO | 31800022 |
EGF | SIGMA | E9644 |
Sodium pyruvate | SIGMA | P2256-25G |
MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED | SIGMA | M5017 |
2、 按要求添加*、*鈉、HEPES等,充分攪拌使之溶解。
3、 調(diào) pH至7.2左右。
4、 加水至zui終體積。
5、 在超凈臺中對溶液進行濾過除菌,分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞緊瓶口。
6、 瓶口封好,4℃冰箱貯存。
小牛血清的處理
市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理,但在使用前還應(yīng)做熱滅活處理,即通過加熱的方法破壞補體(近來也有觀點認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min,其間要不時輕輕晃動,使受熱均勻,防止沉淀析出。
2、 處理后的血清貯存于4℃。
3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質(zhì)量。
生長培養(yǎng)基的配制
除無血清培養(yǎng)之外,各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
培養(yǎng)基分裝成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞緊瓶口。
按如下比例配制: 基本培養(yǎng)基占80%~90%,小牛血清或胎牛血清占10%~20%。 按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(*+*),使*和*的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL,。
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