產品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產品英文名稱：Fluo-4 Calcium Assay Kit

產品中文名稱：Fluo-4鈣離子檢測試劑盒

規格：200T/1000T

貨號：EY-01X8528
用途：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

保存建議:收到貨后，請避光保存于-20℃。請參閱說明書中各個組件的存儲條件，自發貨之日起，按照推薦的保存條件，有效期為12個月。

運輸條件:藍冰運輸

背景

Fluo-4 鈣離子檢測試劑盒是一種基于 Fluo-4 AM 鈣離子熒光探針檢測細胞內鈣離子濃度的試劑盒。本試劑盒可以使用熒光顯微鏡進行熒光成像檢測，也可以使用熒光酶標儀或流式細胞儀進行熒光的定量檢測。使用熒光顯微鏡或熒光酶標儀還可以進行細胞內鈣離子濃度的動態變化檢測。Fluo-4 是一種將 Fluo-3 結構中的 Cl 離子替換成 F 離子的鈣熒光探針。由于將 Cl 離子替換成了電子吸引力更強的 F 離子，它的最大激發波長會向短波長方向偏離 10 nm 左右。這個波長更接近于氬激光器的波長，所以用氬激光器激發時，Fluo-4 的熒光強度比 Fluo-3 更強。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臜產物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數后可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成。
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操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

(二)構建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

(四)誘導表達

1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。