一、載體的構(gòu)建

    外源基因往往不能獨(dú)立復(fù)制，需要與一個(gè)復(fù)制子相連接，使它能被引入宿主內(nèi)并能在其細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。在重組DNA技術(shù)中擔(dān)負(fù)基因轉(zhuǎn)移任務(wù)的復(fù)制子叫載體(vector)。

一個(gè)理想的載體通常應(yīng)具備下列特征。

①能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，或者能有效地協(xié)助外源基因整合到宿主染色體上，使外源基因可以隨宿主染色體一起復(fù)制。

②容易進(jìn)入宿主細(xì)胞。

③有一定的選擇性標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選。

④可插入一段較大的外源DNA，而不影響其本身的復(fù)制。

⑤有合適的限制酶位點(diǎn)便于進(jìn)行克隆。

    另外，還應(yīng)具有較好的安全性、易制備、多拷貝、易于表達(dá)等特點(diǎn)。重組DNA技術(shù)中所用的載體主要是質(zhì)粒和溫和噬菌體(見(jiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo))兩類(lèi)。為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的復(fù)制和表達(dá)，宿主和載體缺一不可，而且不同的宿主需要不同的載體，兩者相輔相成，構(gòu)成完整的宿主一載體系統(tǒng)。這里主要以大腸桿菌和酵母菌宿主為例介紹常用載體。

1. 以大腸桿菌為宿主的載體

    以大腸桿菌為宿主的體系，常用的載體有質(zhì)粒載體、噬菌體載體以及由它們組合而成的復(fù)合型載體(柯斯質(zhì)粒、噬菌粒)等。

(1)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作人工構(gòu)建而成的。與天然質(zhì)粒相比．質(zhì)粒載體通常具有以下特點(diǎn)。

①帶有一個(gè)或幾個(gè)選擇性標(biāo)記基因(如抗生素抗性基因)。

②帶有一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列。

③去掉了大部分非必要序列，使分子量盡可能減少。

④往往還帶有一些多用途的輔助序列。

    常用的質(zhì)粒載體大小一般在1～10kb，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescrjpt(簡(jiǎn)稱(chēng)pBS)系列等。以pUCl9為例，它的大小為2686bp．帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)、一個(gè)*抗性基因、一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子β一半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼n一肽鏈的DNA序列組成的lacZˊ基因、一個(gè)調(diào)節(jié)缸lacZˊ基因表達(dá)的阻遏蛋白(repressor)基因如lacI，以及位于lacZˊ基因中靠近5ˊ端的一段多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)插入外源基因后，將破壞lacZˊ基因，使其不能正常表達(dá)(圖6．5)。篩選含pUCl9質(zhì)粒細(xì)胞的過(guò)程比較簡(jiǎn)單：如果細(xì)胞含有未插入目的DNA的pUCl9質(zhì)粒，在同時(shí)含有誘導(dǎo)物IPTG和X—gal底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將會(huì)形成藍(lán)色菌落；如果細(xì)胞中含有已經(jīng)插入目的DNA的pUCl9質(zhì)粒，在同樣的培養(yǎng)基上培養(yǎng)將會(huì)形成白色菌落。因此，可以根據(jù)培養(yǎng)基上的顏色反應(yīng)十分方便地篩選出重組子。一個(gè)與pUCl9質(zhì)粒十分類(lèi)似的質(zhì)粒是pUCl8，兩者的差別僅在于多克隆位點(diǎn)的插入方向彼此相反。

(2)噬菌體載體 重組DNA技術(shù)中常用的噬菌體載體主要有x噬菌體和一些單鏈DNA噬菌體(如M13噬菌體)。

    野生型的λ噬菌體DNA含有多個(gè)常用限制酶切點(diǎn)，不宜作為載體。經(jīng)過(guò)研究人員的多年努力，目前已經(jīng)成功地構(gòu)建了多種λ載體，這些載體可分為兩類(lèi)。

①插入型載體(insertion vector)，它具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。

②置換型載體(replacement vector)，它具有成對(duì)的酶切位點(diǎn)．兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段可被外源DNA片段置換。

    由于λ噬菌體顆粒有效包裝DNA的長(zhǎng)度范圍為野生型長(zhǎng)度的78％～105％，也就是38～52kb，而λ噬菌體裂解生長(zhǎng)必需基因組就占了28～30kb，岡此可克隆的zui大外源DNA長(zhǎng)度約為24kb。一般插入型載體可克隆的zui大外源DNA長(zhǎng)度在10kb以下，而置換型載體可克隆的外源DNA長(zhǎng)度在9～24kb之間。λ噬菌體載體在DNA文庫(kù)的構(gòu)建中非常有用。

    在大腸桿菌中，還存在一類(lèi)絲狀噬菌體，如M13、fl和fd等，其噬菌體顆粒中包裝的是單鏈(正鏈)的DNA。這類(lèi)特殊的噬菌體在分子生物學(xué)中具有*的地位。現(xiàn)在，M13噬菌體已經(jīng)被發(fā)展成為一種通用的克隆載體。與上述載體相比，M13噬菌體載體的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是，可以方便地獲得含目的基因的單鏈DNA。這種單鏈DNA可廣泛應(yīng)用于核苷酸序列測(cè)定、探針制備和寡核苷酸定點(diǎn)突變等。

(3)柯斯質(zhì)粒(cosmid) 柯斯質(zhì)粒，又稱(chēng)黏粒，是由大腸桿菌質(zhì)粒中插入λDNA的包裝識(shí)別序列cos位點(diǎn)構(gòu)建而成。它是一種特殊的質(zhì)粒載體。大多數(shù)常用的柯斯質(zhì)粒載體大小約為6kb，因此它可克隆的外源DNA片段長(zhǎng)32～46kb，比λ 噬菌體載體可克隆的片段大了約一倍。柯斯質(zhì)粒同時(shí)具有質(zhì)粒和x噬菌體載體的某些特性。

(4)噬菌粒(phagemid) 另一類(lèi)由質(zhì)粒和噬菌體組合而成的特殊質(zhì)粒載體稱(chēng)為噬(菌)粒。噬菌粒是以普通質(zhì)粒載體與絲狀噬菌體M13或f1等為基礎(chǔ)構(gòu)建的，在質(zhì)粒中插入了包括絲狀噬菌體DNA合成起始和終止的順式作用信號(hào)及絲狀噬菌體顆粒裝配所需的序列等絲狀噬菌體主要基因，它同時(shí)具有質(zhì)粒和絲狀噬菌體的特征，因此稱(chēng)為噬(菌)粒(phagemid或phasmid)。與M13噬菌體載體相比，噬菌粒分子量小、克隆能力大、遺傳也更穩(wěn)定。與普通的質(zhì)粒載體相比，噬菌粒的主要優(yōu)點(diǎn)是容易得到單鏈DNA。由pUCl8／19質(zhì)粒發(fā)展而來(lái)的pUCll8／119質(zhì)粒就是典型的噬菌粒載體。

(5)大容量克隆載體 細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chlromosome，BAC)是以大腸桿菌致育因子(F因子)為基礎(chǔ)構(gòu)建的合成載體，含F(xiàn)因子復(fù)制的起始基因和定向基因(oris和repE)。其特點(diǎn)為：拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，克隆的外源DNA的平均大小約120kb，個(gè)別BAC可克隆zui大達(dá)300kb的基因組DNA。BAC可以通過(guò)電穿孔導(dǎo)人細(xì)菌細(xì)胞，其不足之處是對(duì)無(wú)選擇性標(biāo)記DNA的產(chǎn)率很低。P1人工染色體(P1 artificial chlromosome，BAC)是結(jié)合BAC和P1噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)而開(kāi)發(fā)的克隆體系，可以包含60～150kb的外源DNA
片段。

(6)表達(dá)載體根據(jù)載體的不同用途，還有克隆載體和表達(dá)載體之分。克隆載體是指以繁殖DNA片段為目的的載體。這種載體一般本身較小，但可攜帶較大的外源DNA片段．在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)較高。表達(dá)載體則是用來(lái)將克隆的外源基因在寄主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成蛋白質(zhì)的載體。

    大腸桿菌表達(dá)載體通常具有強(qiáng)而可控的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、翻譯起始序列、翻譯增強(qiáng)子和翻譯終止子等與基因表達(dá)有關(guān)的序列。其中啟動(dòng)子是決定基因表達(dá)水平的關(guān)鍵因素。也是構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)優(yōu)先考慮的環(huán)節(jié)．表達(dá)載體的啟動(dòng)子應(yīng)在宿主中具有很強(qiáng)的啟動(dòng)效率。大腸桿菌表達(dá)載體常具有大腸桿菌乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子、*操縱子的trp啟動(dòng)子、λ 噬菌體的PL啟動(dòng)子或者一些復(fù)合啟動(dòng)子等。其次，有些表達(dá)載體自身不帶抑制物基因，使用這類(lèi)載體時(shí)選擇能產(chǎn)生抑制物蛋白的宿主菌，否則目的基因的表達(dá)不能調(diào)控，不利于表達(dá)。另外，用表達(dá)載體獲取蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)還要考慮宿主菌是否合適，因?yàn)楹芏嗨拗骶械鞍酌福瑫?huì)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生降解作用。因此，用作基因表達(dá)的宿主菌一般都要經(jīng)過(guò)改造，使其蛋白酶基因缺失或失活，以便于表達(dá)產(chǎn)物的積累。