實驗開始前，各ELISA試劑盒均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。

3.棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。

4.每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

5.棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6.每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色(反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。

7.每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色，終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。 

8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(值)。