高純試劑供應商齊一生物本指導原則旨在指導注冊申請人對胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（高通量測序法）注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是針對該類試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

胎兒染色體非整倍體（Fetal Chromosome?Aneuploidies）中的 21 三體、18 三體、13 三體（Trisomies 21、Trisomies 18、Trisomies13，即 T21、T18、T13）是臨床上zui常見的染色體非整倍體疾病。其對應的分別為 21- 三體綜合征（又稱唐氏綜合征，先天愚型或 Down 綜合征）、18- 三體綜合征（又稱 Edwards 綜合征）和 13- 三體綜合征（又稱 Patau 綜合征），發病率分別約為 1 /700、1/6000、1/10000，患兒絕大多數存在嚴重智力障礙及器官畸形。

產前篩查和產前診斷是為避免產生遺傳缺陷患兒提供的手段。常規的產前篩查方法包括：早孕期的超聲與血清學聯合篩查和中孕期母體血清學篩查。篩查結果為高風險的孕婦經建議經產前診斷進行zui終確認，由孕婦知情選擇。胎兒染色體異常的產前診斷金標準為介入前產前診斷手術，是指通過絨毛取材術 / 羊膜腔穿刺術 / 經皮臍血管穿刺術，取相應細胞采用細胞生物學方法對胎兒染色體進行核型分析。

高通量測序方法檢測胎兒染色體非整倍體的原理是：孕婦母體血漿中存在胎兒游離 DNA（cell-free DNA，cfDNA），長度約為 75bp—250bp，幾乎全部來源于胎盤的滋養層細胞，其濃度和孕周密切相關并以一定比例（5%—30%）穩定存在于母體外周血漿中。高通量測序方法通過取母體血漿提取包含正常母體和胎兒的血漿游離 DNA，經文庫構建，片段擴增等，zui后進行上機測序，通過軟件分析數據獲得染色體數目評價結果。以檢測 21 三體綜合征為例，當對懷有 T21 胎兒的母體血漿游離 DNA 數據進行分析時，其 21 號染色體游離 DNA 總數會有小比例的升高，通過統計學算法區分這一微小差異來實現利用 cfDNA 進行胎兒染色體非整倍體的產前篩查。但高通量測序法不能對染色體結構異常進行檢測，不能代替傳統篩查中的開放式神經管缺陷篩查等。

本指導原則所述的胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（高通量測序法）是指通過高通量測序法檢測孕婦外周血血漿中胎兒游離脫氧核糖核酸（DNA），通過分析樣本中的胎兒游離 DNA 的 21 號、18 號及 13 號染色體數量的差異，預期用于對胎兒染色體非整倍體疾病 21- 三體綜合征、18- 三體綜合征和 13- 三體綜合征進行產前篩查的檢測試劑盒。

本指導原則所述的高通量測序法，是指通過文庫構建、片段擴增進而進行上機測序的第二代測序方法，不需要進行片段擴增的第三代、第四代單分子測序方法在文中并未涉及。但高通量測序技術發展迅速，第三代、第四代單分子測序方法在企業內部參考品設置、性能評估或臨床評價等處如有適用的方面，可以參照執行。

本指導原則所述檢測試劑盒的適用人群為：對孕周為 12+ 0 周及以上的孕婦進行產前篩查，其結果不能代表對孕婦懷有三體胎兒的確認，產前篩查的結果必須要經過產前診斷進行確認。

倫理學原則應遵守國家相關法律法規及行業規定。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他內容。其中，其他內容包括同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從方法學及檢出限等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第 5 號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告 2014 年第 44 號，以下簡稱“公告”）的相關要求。

綜述資料應詳細闡明檢測原理，可配合圖示并寫明一個完整檢測配合使用的全部試劑及耗材名稱、生產廠家、貨號或注冊證書號以及詳細的組成成分。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料的研究資料包括企業內部參考品和完成檢測所需試劑組成兩部分。

1. 企業內部參考品應至少包括：陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、嵌合體參考品，具體要求如下：

1.1 陽性參考品：應采用 T21、T18、T13 胎兒 DNA 段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本。

1.2 陰性參考品：應包括采用染色體數目正常胎兒 DNA 段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本，以及采用其他染色體異常胎兒 DNA 段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本。其他染色體異常的陰性參考品由申請人依據常見染色體異常項目并根據對產品的質控要求自行選擇。

1.3 檢測限參考品：應采用 T21、T18、T13 胎兒 DNA 段按不同比例梯度與正常女性血漿混合的模擬樣本，如 5%、3.5%、2.5% 等，建議采用 95%（n≥20）的陽性檢出率作為zui低檢測限確定的標準。

1.4 嵌合體參考品：由申請人按照對產品的質控要求自行設定模擬 T21、T18 和 T13 嵌合體的組成比例，如 70% 異常，30% 正常；30% 異常，70% 正常等。

T21、T18、T13 及其他染色體異常胎兒 DNA 段可由產組織或羊水細胞、細胞系等來源制備。

申請人應詳細說明企業內部參考品的組成、詳細說明制備及檢定方法、胎兒 DNA 段濃度確認方式和所占比例的選擇依據。組成各項企業內部參考品的樣本應為不同來源。

2. 完成全部檢測流程所需試劑一般應至少包括：血漿游離 DNA 提取純化試劑、文庫構建試劑、文庫定量試劑、測序試劑、陰性質控品、陽性質控品以及與之配合使用的測序芯片和數據分析軟件。具體要求如下：

2.1 血漿游離 DNA 提取純化試劑：無論申報產品中是否包含，申請人均應提交配合使用的提取純化試劑的原理、詳細組成成分、生產廠家、貨號及*類醫療器械備案憑證編號的相關資料。性能方面需對該試劑提取的 DNA 段長度范圍準確性及純度要求，提取效率、重復性及抗干擾能力進行評估。

2.2 文庫構建試劑、文庫定量試劑、測序試劑：文庫構建試劑對片段化的 DNA 進行缺口補平及相應部分 5‘端磷酸化（如需）和 3’端去磷酸化（如需），之后使用連接酶加上用于測序和分析的標簽和接頭，構建成可以用來測序上機的標準文庫；文庫定量試劑通過 PCR 擴增及與標準品曲線的比對，用于定量測定文庫濃度，為后續均一化文庫進行上機測序做準備，同時能夠評估文庫構建的質量。文庫定量時應明確對文庫質量、片段大小及濃度要求，應提供分析圖譜，對其中參數進行解釋說明（如是否有雜峰，產生的原因，是否對zui終結果產生影響等）。文庫定量不限于上述方法，也可采用其他方法進行，如熒光染料法、Qubit 定量等；測序試劑用于對均一化的文庫進行片段擴增，通過基因測序儀捕捉擴增過程中堿基的變化引起的信號變化來達到讀取序列的目的。

以上三種試劑一般由：相應功能的酶（末端修復酶、DNA 連接酶、缺口修復酶 DNA 聚合酶等）、核苷酸序列（引物、接頭序列、標簽序列、文庫定量標準品）、緩沖液及 dNTP 組成。具體要求如下：

2.2.1 酶：應提交純度、活性及功能性試驗資料。例如：文庫構建過程包括但不限于末端修復酶、DNA 連接酶、缺口修復聚合酶等，所選擇的酶應當具有末端突出削平、缺口補平、標簽或接頭連接、DNA 聚合酶活性。

2.2.2 核苷酸序列：應提交相應的序列組成和純度信息，序列準確度；引物設計應提交引物設計原則及選擇對比依據。

2.2.3 緩沖液：應明確詳細的組成及各鹽濃度選擇對比的依據。

2.2.4 dNTP：包括 dATP、dGTP、dCTP、dTTP，應提交對純度、濃度等的詳細驗證資料。

2.3 陰、陽性質控品：須能夠監控 DNA 段提取到zui終測序結果全過程，因此應當由陰、陽性（T21、T18 和 T13）胎兒 DNA 段按已知比例與正常女性血漿基質混合組成。

2.4 測序芯片：應詳細闡明芯片進行片段擴增的原理及結構，明確使用芯片型號，并對同一次測序芯片上樣的樣本間精密度進行評價。

2.5 數據分析軟件：舉例介紹原始數據質量評估、數據處理和篩選的方法，明確數據篩選依據以及使用的算法。

2.6 提交不同原材料對于zui終測序數據質量影響的評估材料。由于各測序平臺的技術側重點不同，數據質量評估的項目可能存在差異，需考慮包括但不限于以下方面：文庫濃度、文庫片段大小、單樣本總序列數（數據量）、*比對率、單次檢測的 GC gap（zui高 GC 值與zui低 GC 值的差值）等。

2.7 除上述資料，申請人還應提交主要原材料的篩選依據及試驗資料。如為自制，則應提交：制備方法、質量要求、質量檢測方法、對比篩選的試驗資料等；如為外購，則應提交：外購證書、質量要求、質量檢測方法、對比篩選的試驗資料等。其中，對比篩選的試驗資料應包括篩選過程中的數據、圖譜、對比圖表等信息。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1. 主要生產工藝包括配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對關鍵參數進行有效控制。所提交申報資料中應包括主要生產工藝介紹和生產工藝流程圖，后者需標明關鍵工藝質控步驟，并詳細說明該步驟的質控方法及質控標準。

2. 反應體系研究指完成檢測所涉及到的佳反應條件的選擇確定過程，包括對提取純化步驟、游離 DNA 段的末端修復、接頭及標簽連接、文庫定量、片段擴增、測序反應的反應條件及反應體系的選擇確定，涉及到對樣本類型、樣本用量、試劑用量、緩沖體系的選擇、反應溫度和時間條件及檢測過程中質控方法確定的依據。重點關注：酶濃度、引物濃度、dNTP 濃度、離子濃度、加樣量及反應體積、片段擴增各階段溫度、時間及循環數、測序數據質量的評估指標等，其中加樣量和反應體積應參考相應行業標準，經研究驗證后確定。

此外，還應對數據量及胎兒游離 DNA 濃度和比例對檢測結果的影響進行研究。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交產品在產品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的全部性能的評估資料，對于每項分析性能的評價都應包括研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能評估的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、人員及數量、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批準指南（CLSI-EP）文件或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。建議著重對以下分析性能進行研究：

1. zui低檢出限：建議使用企業參考品進行梯度稀釋并多次檢測，將具有 95% 陽性檢出率的胎兒游離 DNA 濃度水平作為zui低檢出限。企業參考品應使用*的準確定量方法進行，zui低檢出限應描述為 XX DNA 濃度下可檢出胎兒 DNA 的zui小百分比。

2. 企業內部參考品符合率：對試劑檢測企業內部參考品的符合情況進行評估。

3. 精密度：精密度的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同產品特征或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性，具體實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批準指南（CLSI-EP）或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

3.1 對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離 / 純化組分）本身的影響外，應對高通量基因測序儀、操作者、地點、合理的精密度評價周期等要素進行相關的驗證。

例如：為期至少 XX 天的連續檢測，每天至少由 2 人完成不少于 2 次的完整檢測，從而對批內 / 批間、日內 / 日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。申請人還應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

3.2 用于精密度評價的模擬樣品和臨床樣本均應至少包含 3 個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據產品特性設定適當的精密度要求。精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

4. 干擾試驗：包括內源性干擾物質和外源性干擾物質。應針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在干擾物質的潛在zui大濃度（即“zui差條件”）條件下進行評價。內源性干擾物質的評價至少應包括膽紅素、游離血紅蛋白、甘油三酯。

5. 特異性：對以下是否干擾 T21、T18、T13 陰陽性的檢出能力進行評價：

5.1 微缺失、微重復評價：申請人應采用一定比例的微缺失、微重復胎兒 DNA 與正常女性血漿混合制備微缺失、微重復模擬樣本進行評價。

5.2 嵌合體評價：申請人應采用不同嵌合比例的模擬 T21、T18 和 T13 嵌合體樣本對試劑檢測嵌合體的能力進行評估，對不能檢測到的模擬嵌合體的嵌合比例進行確認。

5.3 對其他常見染色體樣本的干擾進行評價。

微缺失微重復模擬樣本、嵌合體模擬樣本及其他常見染色體樣本的類型和數量由申請人選擇確定，并在產品說明書中明確。

（五）陽性判斷值的確定資料

由于目前胎兒染色體非整倍體 T13、T18、T21 的陽性判斷值存在多種計算方式，且更好的算法和數據處理方式仍在不斷開發中。因此，如申請人選擇了某一算法作為陽性判斷值的計算方式，則應詳細闡述選擇該算法作為陽性判斷值依據的原因（如文獻、行業共識等），并詳細闡述計算公式和各參數代表的意義。

以大樣本量常用的 Z - 值（Z-score）算法來舉例說明：

1.Z- 值這個統計量反應的是當前數值距離平均數的相對標準距離，Z- 值的應用條件為大樣本量以及數據符合正態分布，計算公式如下：

1.1chrN z-score for test sample: 所檢測樣本的 Z - 值；

1.2 N：的第 N 染色體；

1.3%chrNsample：待測樣品第 N 條染色體*比對序列數占常染色體的百分比，通過高通量測序后軟件分析獲得；

1.4 Mean%chrNreference：參照樣品第 N 條染色體比例平均值；

1.5S.D.%chrNreference：參照樣品第 N 條染色體比例的標準偏差。

該公式中，影響*比對序列的因素包括 GC 含量、檢驗覆蓋度等，申請人應計算并統計檢驗覆蓋度是否在正常范圍內。參照樣品的數量、來源等均對其數據產生影響，進而影響 Mean%chrNreference 和 S.D.%chrNreference。因此，申請人需對參照樣品的數據計算進行詳述，并提供計算值。

2. 被篩查孕婦所懷胎兒的染色體數量狀況符合正態分布，即大概率為正常染色體數量，小概率事件為胎兒染色體非整倍體，如圖 1 所示：

如圖 1 可以看出，出現在 Z - 值為正負 3 以外的數值，則有 99.9% 的可能為陽性，因此，通常將 Z - 值 = 3 定為陽性判斷值分界點，Z- 值 >3 或 Z - 值 <- 3 判斷為胎兒染色體非整倍體陽性。？申請人應當根據試驗對 z - 值 >3 及 Z - 值 <- 3 的情況分別進行說明。<>

鑒于并無 99% 陰陽性分界點，一般來說，申請人應設定陽性判斷值灰區范圍，灰區的設定應提交理論和實際試驗結果的依據，并在說明書【陽性判斷值】和【檢驗結果的解釋】項進行解釋說明，如：是否需要用產前診斷的方式進行zui終確認，可能的原因，是否需要孕齡再大時進行再次抽血復測等等。如無灰區設置，也應提交理論和大樣本量試驗結果的依據。

在陽性判斷值設定后，申請人應當選取一定數量陰、陽性真實臨床樣本進行試驗驗證，如與該公式不符，則應說明出現的問題及詳細的數據校正方式。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。主要涉及兩部分內容，申報產品的穩定性和適用樣本的穩定性研究。

1. 申報產品的穩定性研究主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2. 適用樣本的穩定性研究主要包括對含有游離 DNA 的孕婦血漿的保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證以及血漿游離 DNA 提取后儲存條件的驗證。可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行檢測，從而確認樣本的穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

應注意運輸穩定性、開瓶穩定性等研究實際上均指經運輸或開瓶后對產品效期及檢測性能是否有影響，因此申請人應在試驗設計中充分考慮上述因素。此外，產品穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）產品技術要求

擬定產品技術要求應符合《辦法》、“公告”和《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告 2014 年第 9 號）的相關要求。

如果擬申報試劑已有相應的國家 / 行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

（八）產品注冊檢驗報告

根據總局第 5 號令要求，申請注冊的第三類產品應在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢驗。該產品已有國家參考品發布，在注冊檢驗時應使用“高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18 和 T13）國家參考品”進行。

（九）產品說明書

產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告 2014 年第 17 號）的要求，進口產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對說明書的重點內容進行詳細說明。

1.【產品名稱】

建議按照如下方式命名：胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（方法學）或胎兒染色體非整倍體（T21/T18/T13）檢測試劑盒（方法學）。

舉例：胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（半導體測序法）、胎兒染色體非整倍體（T21/T18/T13）檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）。

2.【預期用途】

2.1 *自然段：預期用途描述，包括被測孕婦孕周特征，樣本類型等。

舉例：該產品用于定性檢測孕周為 12+ 0 周及以上的孕婦外周血血漿中胎兒游離脫氧核糖核酸（DNA），通過分析樣本中的胎兒游離 DNA 的 21 號、18 號及 13 號染色體數量的差異，對胎兒染色體非整倍體疾病 21- 三體綜合征、18- 三體綜合征和 13- 三體綜合征進行產前篩查。如試劑盒僅是測序步驟中的建庫步驟，則預期用途應描述為“構建測序文庫”。

2.2 第二自然段：按照《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》介紹臨床適應癥及背景，說明相關的臨床或實驗室診斷方法等，應介紹產前診斷金標準。

2.3 第三自然段：明確該產品僅作為 21 號、18 號及 13 號染色體的產前篩查用途，其結果要由產前診斷金標準進行確認并遵守相關法律法規及行業規范。

3.【檢驗原理】

詳細說明該產品檢測母體胎兒游離 DNA 判斷染色體數量的檢測原理及方法學原理（必要時可用圖示進行）。

4.【主要組成成分】

說明試劑盒所包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應列出相關試劑 / 耗材的名稱、生產企業、貨號、注冊證號 / *類醫療器械備案憑證編號（如有）及其他相關信息，測序芯片應明確型號。

5.【儲存條件及有效期】

5.1 按照穩定性研究資料，說明試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及效期。

5.2 按照《醫療器械說明書和標簽管理規定》（總局令第 5 號）增加生產日期，使用期限或者失效日期。

6.【樣本要求】

6.1 樣本采集要求。

6.2 說明對采血管及抗凝劑的要求。

6.3 樣本保存、運輸及處理：孕婦外周血樣本的保存條件（溫度、保質期限）、運輸條件、處理條件（如：多長時間內必須分離血漿）；已分離的血漿樣本的保存條件（溫度、保質期限）、運輸條件、處理條件（如：核酸提取前的預處理）；冷藏 / 冷凍樣本檢測前是否需恢復至室溫，凍融次數的要求。

上述內容均需在穩定性研究資料中詳述并用產品進行性能評估驗證。

7.【適用機型】

適用的測序儀器具體型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

8.【檢驗方法】

無論是否包含提取試劑或測序試劑，申請人應從頭詳細描述完成完整檢測所需的全部步驟以指導用戶正確操作，包括血漿游離 DNA 的提取、文庫構建、文庫定量、片段擴增及上機測序。該類產品操作程序較多，作為產品使用說明書該項內容應當盡量詳細，以能夠指導用戶進行操作，其中應當包括各步驟的注意事項及配合使用物品的技術參數、儀器廠家和型號（如 PCR 儀，生物分析儀等）和反應條件，以半導體測序為例：

8.1 DNA 提取：DNA 提取方式、提取試劑盒貨號及*類醫療器械備案憑證編號；DNA 提取液的短期和保存方式、凍融次數等。

8.2 文庫構建：末端修復、接頭連接、缺口修復、PCR 擴增；所構建的文庫短期和保存方式，凍融次數等。

8.3 文庫定量；描述對于定量后文庫濃度和質量的要求，以及何種情況進行文庫的重新構建。

8.4 測序模板的制備：混合文庫、PCR、模板富集。

8.5 上機測序：儀器準備、設置及儀器使用相關參數。

9.【陽性判斷值】

明確設定陽性判斷值所使用的算法及驗證參考值所使用的樣本例數及類型。如使用軟件，則應明確軟件名稱、*標識號、生產廠家及醫療器械注冊證書編號；如暫未取得醫療器械注冊證書，應空出相應內容，在軟件名稱后注明（醫療器械注冊證書編號：）。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1 本試劑盒作為胎兒染色體非整倍體篩查檢測，其結果僅供臨床參考，不能作為診斷的*依據。對患者的臨床診斷應采用金標準方法（染色體核型分析）并結合其癥狀 / 體征、病史及其他實驗室檢查等情況綜合進行。本試劑盒不能對胎兒染色體結構異常進行檢測。

10.2 本試劑盒適用于孕婦外周血血漿樣本檢測，不適用于其它樣本檢測。

10.3 胎兒游離 DNA 濃度在孕婦外周血中存在較大個體差異，變化范圍從 2% 到 30% 不等且和孕周密切相關，因此若因胎兒游離 DNA 濃度較低造成檢驗失敗時，可待孕周較大時再次抽血檢測。

10.4 以下幾種情況的孕婦樣品可能會出現假陽性或假陰性結果，需要結合其他檢測結果進行綜合判斷：

10.4.1 孕婦本人為染色體非整倍體疾病患者、其他染色體疾病患者或攜帶者；

10.4.2 胎兒染色體異常中的平衡易位、嵌合型三體異常；

10.4.3 懷有雙胎或者多胎（三胎及三胎以上）的孕婦；

10.4.4 近期接受過移植手術、干細胞治療；近期接受過免疫治療或輸注過異體血制品；

10.4.5 孕婦本人為腫瘤患者；

10.4.6 通過體外受精—胚胎移植（IVF-ET）方式受孕的孕婦；

10.4.7 體重嚴重超重的孕婦。

10.5 樣本采集、運輸及處理不當、未按說明書操作均有可能導致假陽性或假陰性結果；描述在樣本采集，保存、運輸中需遵循的原則及注意事項，例如：

10.5.1 描述適用的抗凝采血管；

10.5.2 顛倒混勻時動作應輕柔，防止溶血；

10.5.3 全血離體后須進行血漿分離的時間；

10.5.4 血漿分離過程中注意不要吸到中間層的白細胞；

10.5.5 血漿樣本是否能夠進行反復凍融；

10.5.6 禁止將 XX 抗凝樣本和血漿樣本在室溫狀態下放置；

10.5.7 血漿樣本寄送采用的運輸保存方式。

10.6 其他局限性。

11.【產品性能指標】

按照分析性能評估資料內容詳述以下性能指標：zui低檢出限、企業內部參考品符合率、精密度、干擾試驗、特異性。各項評估應包括評估方法、數據和結果。應將臨床評價的試驗結果納入，包括臨床試驗機構數量、樣本例數、試驗結果等內容。

（十）臨床評價資料

1. 研究方法

對照方法：依據衛生部（現國家衛生與計劃生育委員會）發布的“《WS322.2-2010 胎兒染色體異常與開放性神經管缺陷的產前篩查與診斷技術標準》第 2 部分：胎兒常見染色體異常的細胞遺傳學產前診斷技術標準”，以介入性產前診斷手術結果（包括絨毛取材術、羊膜腔穿刺術和經皮臍血管穿刺術）和出生隨訪結果作為確診胎兒染色體非整倍體 T21、T18、T13 的對照金標準。對于出生隨訪，應在方案中明確隨訪由新生兒醫師進行，各機構在制定方案中對醫師進行統一的培訓，采用科學的、統一的評價標準和評價項目（應當提供依據）對出生后嬰兒表觀進行是否是三體患兒的診斷，也可采用出生后采血進行核型分析的方式進行診斷。

研究方法為前瞻性研究，是指對臨床需要正常進行產前診斷的孕婦采集樣本與金標準檢測進行對比分析。

統計學分析一般選用交叉四格表的形式總結本試劑盒測序結果和金標準檢測結果并進行卡方或 kappa 檢驗，與金標準比對進行敏感性、特異性分析，計算陽性預測值、陰性預測值。對于以上統計值，均應做統計假設，并報告 95% 置信區間。

2. 臨床研究機構及人員

臨床研究機構應為已取得產前診斷技術服務資質的醫療機構。人員應為經過專門培訓的取得資質的人員。機構和人員應遵循《產前診斷技術管理辦法》《母嬰保健專項技術服務許可及人員資格管理辦法》，機構取得《母嬰保健技術服務執業許可證》，人員取得《母嬰保健技術考核合格證書》。

3. 適用人群及樣本量

適用人群為孕周為 12+ 0 周及以上的孕婦。不同年齡段孕婦應按自然比例分布，35 歲及以上孕婦占比應控制在 10%—15%。樣本量依據統計學及胎兒染色體三體發病率計算，根據其臨床預期用于產前篩查的用途，按照發病率計算建議總例數不少于 10000 例。

試驗要求能夠篩選出一定數量的 T21 陽性、至少 1 例的 T18 陽性和至少 1 例的 T13 陽性。如未篩查出符合要求的陽性病例數量，則應繼續增加樣本例數進行篩查，所有樣本均應可以溯源。

4. 其他要求

4.1 對于臨床試驗中可能會出現用于核型分析的細胞培養不出導致數據缺失的情況：密切關注該病例并建議孕婦做二次穿刺，zui終確定結果可納入統計分析；

4.2 關于失訪率的要求：核型分析屬于有創檢測，如孕婦拒絕二次穿刺將導致數據失訪；出生隨訪可能有部分數據失訪。因此，可接受的失訪率應控制在高危孕婦≤2%，低危孕婦≤10%，且失訪數據應說明原因。

4.3 臨床試驗結果的客觀內容（包括失訪率等）建議在產品說明書中明示。

5. 臨床試驗方案

5.1 申請人按照上述 1—4 要求并結合體外診斷試劑注冊申報相關法規制定臨床試驗方案。需遵循如下要點：

5.1.1 各臨床研究機構的方案應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。臨床試驗方案的修改過程和版本要記錄在案，且每次改動應記錄原因。

5.1.2 整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

5.2 臨床試驗方案還應詳細闡述如下內容：

5.2.1 臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介；對臨床試驗的整體管理情況、質量控制、試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行的規定。

5.2.2 臨床背景、病例納入 / 排除標準、樣本的預期選擇例數及標準。其中須注意，病例納入 / 排除標準應嚴格制定并實施，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性，對于編盲的方式應有詳細描述。

5.2.3 如采用出生隨訪方式，則應對出生隨訪的依據、項目及判定標準進行詳細規定，包括但不限于如下內容：隨訪操作及記錄人員、復核人員、隨訪方式、隨訪項目、判定依據、隨訪時間周期及間隔、隨訪終點等。

5.2.4 樣本類型、樣本的收集、處理及保存等。

5.2.5 數據預處理、統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

6. 臨床試驗報告

臨床實驗報告包括各機構的臨床試驗報告以及臨床總結報告。根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告 2014 年第 16 號）的要求，臨床試驗報告應該與方案呼應并相一致，對方案執行情況及試驗結果進行詳述：

6.1 樣本例數（總結報告應為各機構的樣本例數、陽性檢出例數等）、孕婦年齡分布情況、建議以列表方式給出具體例數及百分比。

6.2 對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

6.3 具體試驗過程及試驗過程中需要說明的問題，研究過程中是否涉及對方案的修改。

6.4 申報試劑批號、有效期及所用機型等信息，配合使用的試劑、耗材及儀器的廠商信息、貨號及產品醫療器械注冊證編號。需要強調的是：臨床試驗研究應使用與說明書描述一致的配套使用試劑及儀器。

6.5 統計學分析：樣本的納入與排除情況；數據預處理、差異數據的重新檢測與否以及zui終是否納入數據統計、對異常值或缺失值的處理。另外考慮到對不同年齡段孕婦樣本的陽性檢出率可能存在一定差異，故建議對不同年齡段孕婦樣本分別進行統計分析。

6.6 討論和結論：對總體結果進行總結性描述并分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，zui后得出臨床試驗結論。

6.7 病例報告表應包括如下信息：孕婦代碼、年齡、金標準分析具體結果、該試劑檢測結果。其中金標準分析如為核型分析，應明確具體結果；如為出生隨訪，則應明確胎兒出生時間、隨訪時間、隨訪方式、隨訪結果。病例報告表的全部數據應可溯源。

7. 上市后需完成的工作

上市后需繼續搜集至少 10 家臨床機構、總數不少于 10 萬例臨床使用數據作為臨床補充資料在產品下一次延續注冊時提交，并使用該試劑檢測的全部結果（包括陰性、陽性）與衛生主管部門關于胎兒染色體產前診斷技術標準以羊水穿刺核型分析或出生隨訪結果作為金標準進行對照。對于出現在灰區（如適用）的樣本（Z 值臨界值區域）應進行分析總結。該項臨床資料應當由出具數據各臨床機構主管部門簽章。此外，注冊人還應總結上市期間假陽性和假陰性的例數并詳細分析產生原因。

在延續注冊時，注冊人應依據上市后的臨床使用數據進一步修訂說明書臨床性能相關內容。

三、名詞解釋

1. 高危孕婦

本指導原則中是指建議實行產前診斷的人群：35 歲以上的高齡孕婦；產前篩查出來的胎兒染色體異常高風險的孕婦；曾生育過染色體病患兒的孕婦；產前 B 超檢查懷疑胎兒可能有染色體異常的孕婦；夫婦一方為染色體異常攜帶者；醫師認為有必要進行產前診斷的其他情形。

2. 低危孕婦

本指導原則中是指除去定義為高危孕婦以外的孕婦人群。

四、參考文獻

1.《產前診斷技術管理辦法》（中華人民共和國衛生部令第 33 號），2002 年 12 月 13 日。

2.《孕婦外周血胎兒游離 DNA 產前篩查與診斷技術規范》（國衛辦婦幼發〔2016〕45 號），2016 年 11 月 9 日。

3. 中華人民共和國衛生行業標準（WS 322.1-2010），胎兒常見染色體異常與開放性神經管缺陷的產前篩查與診斷技術標準第 1 部分：中孕期母血清學產前篩查。

4. 中華人民共和國衛生行業標準（WS 322.2-2010），胎兒常見染色體異常與開放性神經管缺陷的產前篩查與診斷技術標準第 2 部分：胎兒染色體異常的細胞遺傳學產前診斷技術標準。

5.Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy,ACOG, 2015.

6.Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update, ACMG, 2016.

7.Position Statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on Behalf of the Board of the international Society for Prenatal Diagnosis, ISPD, 2015.

8.Guidelines for diagnostic next-generation sequencing, guidelines for the evaluation and validation, EuroGentest and the European Society of Human Genetics, 2016.

9.Use of Standards in FDA Regulatory Oversight of Next Generation Sequencing （NGS）-Based In Vitro Diagnostics （IVDs） Used for Diagnosing Germline Diseases, Draft Guidance for Stakeholders and Food and Drug Administration Staff, FDA, 2016.

10.《出生缺陷防治報告》，中華人民共和國衛生部，2012。