基因組DNA和質粒DNA的分離和定量注意事項

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本部分介紹從不同樣本來源分離和定量基因組DNA，以及分離和定量質粒DNA的注意事項。此外，本部分內容還涉及通用的質粒DNA處理操作，包括如何制備和轉化感受態細胞，如何培養和處理含有質粒的細胞，以及一些基因組DNA分析通用的技術。

何為DNA？

基因組DNA

基因組DNA構成了生物體的完整遺傳信息。幾乎所有生物體的基因組組成都是DNA，僅有的例外是具有RNA基因組的部分病毒。基因組DNA分子通常較大，且在多數生物體中是以DNA-蛋白質復合物（即所謂的染色體）的存在。不同生物體的染色體的尺寸、數量，以及基因組DNA的性質各異。病毒DNA基因組相對較小，可以為單戀或雙鏈，線狀或循環狀。所有其它生物體的基因組都是雙鏈DNA形式。細菌具有單個循環狀的染色體。在真核生物體內，多數基因組DNA位于細胞核內（核內DNA），構成多條不同尺寸的線狀染色體。此外，在真核細胞的線粒體內，以及植物和低等真核生物的葉綠體內，也額外含有基因組DNA。這一類DNA通常為環狀分子，以這些細胞器內的多拷貝形式存在。

基因組DNA含有基因，即對蛋白質或RNA進行編碼的不連續區域。基因包含編碼DNA序列，以及控制基因表達的相關調控元件。真核基因還含有稱為內含子的非編碼區域。不同生物體的基因數量存在很大差異。編碼DNA僅占真核生物基因組DNA的一小部分：大量的DNA是不編碼的，其中的多數由重復序列構成。部分不編碼DNA具有結構和調控功能；但多數此類DNA的功能仍多半處于未知階段。不同生物體細胞內每個遺傳位點的拷貝數目（又稱倍體摂）也存在差異。有性生殖的生物體的體細胞通常為二倍體，即具有兩套類似的染色體，因此各個遺傳位點也具有兩份拷貝；而生殖細胞則是單倍體，僅具有各個染色體的一份拷貝。原核細胞為單倍體。部分植物為多倍體，如現代小麥就是六倍體（每個染色體六份拷貝）。

質粒DNA

細菌質粒為雙鏈閉合環狀DNA分子，大小為1 kb 到大于200 kb不等。細菌質粒已在一系列細菌種屬中發現，它們是獨立于細菌染色體進行遺傳和復制的附加遺傳單位。但想要成功轉錄和復制，它們仍然要依賴宿主提供的酶和蛋白質。

質粒中通常含有編碼（在部分環境下）有利于宿主細胞的酶的基因。這些編碼的酶可能會參與抵制環境內檢出的毒素（例如，復雜的有機復合物）或者細菌自身產生的毒素，或生成相應的抗體。 

質粒DNA純化后，可用于測序、PCR、蛋白表達、轉染以及基因療法等一系列下游應用。

DNA提取技術

DNA可采用許多種方法進行純化，但下游應用真正決定了DNA的純化方法。除了采用自制方法（例如，CsCl離心梯度純化法）進行分離外，許多供應商還提供了DNA提取試劑盒。3種zui通用的DNA提取試劑盒的特征如下表所示。

陰離子交換法純化出的DNA的純度和生物活性，至少相當于兩輪CsCl梯度純化，但用時僅相當于后者的零頭而已。純化出的核酸具有zui高品質的質量，是敏感的下游生物學應用（如轉染、顯微注射、測序和基因療法研究）的理想選擇。

二氧化硅膜技術純化出的高純度核酸適于大多數分子生物學和臨床研究應用，如限制消化、連接、標記、擴增，以及放射性和熒光測序。

磁性顆粒技術純化出的高純度核酸適于臨床和獸醫研究中的大多數分子生物學應用，如限制消化、連接、標記、擴增，以及放射性和熒光測序。磁性顆粒技術常常可以實現自動化，以快速、經濟地開展核酸純化操作。

DNA研究：良好的實驗室規范

處理DNA

DNA是一種相對穩定的分子。但應避免在DNA溶液中引入核酸酶，因為此類酶會造成DNA降解。基因組DNA由超大的DNA分子構成，因此較為脆弱，極易被破壞。為確保基因組DNA的完整性，應避免進行過多和過于粗糙的移液和渦旋振蕩操作。DNA儲存在水中時，極易酸性水解，因此應將其儲存在TE緩沖液中，詳見下表。

核酸換算：DNA

DNA的分子量換算

• 雙鏈DNA分子的MW（鈉鹽） = （堿基對數目） x （662 分子量/堿基對）
• 單鏈DNA分子的MW（鈉鹽） = （堿基對數目） x （331 分子量/堿基對）
• DNA核苷酸酶的MW（鈉鹽，pH ≥7）：
• MW = (N_A x 335.2) + (N_C x 311.2) + (N_C x 351.2) + (N_T x 326.2) + P

其中N_X = 寡核苷酸內各核苷酸殘基數目（各核苷酸列明的MW為（在相應鈉鹽條件下）融合到寡核苷酸內的相應核苷酸的MW） 
對于脫磷酸化寡核苷酸：P = –84.0 
對于磷酸化寡核苷酸：P = 40.0

DNA的分子換算

DNA的分子換算請見表：微克DNA換算和皮摩爾DNA換算。蛋白質/DNA換算請見表：蛋白質/DNA換算。

分光光度法測定DNA濃度

DNA和RNA的濃度應通過分光光度計測定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來測定。出于準確度需要，260 nm下的吸光度讀數應將至0.15到1.0之間。

在10 mM Tris•Cl、pH 8.5條件下，純凈的DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比率為1.8–2.0之間。

A₂₈₀處的強吸光度會造成較低的A₂₆₀/A₂₈₀ 比率，這表示有蛋白質等污染物存在。

在270 nm和275 nm處的強吸光度則表示存在污染物苯酚。

在325 nm處的吸光度表示很可能存在溶液或臟污的器皿造成的污染。

基因組DNA提取之前的樣本儲存

起始材料的質量影響著分離的DNA的質量和產量。純化來自于新鮮采集的組織和細胞的基因組DNA時，可以達到zui高的DNA產量和質量。如果樣品在采集之后無法即時處理，則可將其儲存在可保留DNA完整度的條件下。總的來說，如果樣品，尤其是動物樣品，在未經處理的情況下在2–8°C或–20°C條件下儲存，會造成基因組DNA的產量下降。此外，應避免對凍存樣品反復凍融，因為這會造成基因組DNA大小變小，同時還會造成病原DNA（例如，病毒DNA）的產量下降。我們將在下文討論不同起始材料建議的儲存方法。

血液

將要儲存的血液樣品中應添加抗凝劑。例如，采用肝素或EDA處理的血液樣本可在2–8°C下儲存數天，或在–20°C或–80°C下儲存數周。此外，采用ACD溶液B （0.48%檸檬酸，1.32%檸檬酸鈉，1.47%葡萄糖；每6 ml血液使用1 ml）處理的血液樣本，在2–8°C下至少可儲存5天，在–20°C下至少可儲存1個月。如需儲存，可準備血液細胞核，并在–20°C下儲存。

其它臨床樣本

大多數生物液（例如，血漿、血清和尿液）和糞便樣本可在2–8°C下儲存數小時。如需儲存，建議在–20°C或–80°C下冰凍。拭子可在室溫下干燥儲存。

福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)是另一種樣本儲存方法，尤其適用于臨床組織樣品。根據組織類型，生物分子在收集后發生分解、誘導或改性的速度存在差異。因此，組織切除和固定的操作步驟應盡可能簡短、快捷。

組織的固定涉及將樣本放入福爾馬林溶液的步驟，而后者的組分則存在各種差異（常用的10%福爾馬林溶液含有3.7%的甲醛和1–1.5%的甲醇）。由此引發的化學反應導致生物分子之間發生交聯，包括核酸之間、蛋白質之間以及核算和蛋白質之間的交聯。為獲得*的固定結果，應采用中性緩沖的福爾馬林溶液，而非未緩沖或酸性的福爾馬林溶液。中性緩沖液可減緩福爾馬林的降解，目前可以確信的是后者降解的產物會對核酸質量造成一定程度的破壞。

為確保*的固定效果，福爾馬林和組織的體積比應至少達到10:1。在處理較小的組織樣本（如針穿刺吸取組織活檢樣本）時，這一目標很容易實現。但在處理體積較大的組織樣本時，用于組織固定的福爾馬林溶液則可能會出現不足。在此情況下，應將組織切片之后再進行福爾馬林固定。為避免過度固定(overfixation)，組織固定時間應不超過24小時。

經過福爾馬林固定后，組織樣本將要包埋在石蠟中，這一過程包括幾步。*步脫水，即采用酒精（通常為乙醇）取代水。接下來兩步為：透明，即采用二甲苯和二甲苯替代物取代酒精；浸蠟：即用石蠟取代二甲苯。zui后一步是包埋，即整個組織用石蠟包裹起來。在浸蠟之前，確保組織樣本已*脫水非常重要，因為殘留的水分會造成樣本降解。為避免酒精和二甲苯因之前使用而可能攜帶水分，建議始終采用新鮮的酒精和二甲苯。為確保自FFPE樣本恢復可用的DNA時能獲得*恢復效果，應采用較低的解凍溫度解凍石蠟。此外，應避免采用含有蜂蠟等添加劑的石蠟，因為這一類添加劑可能會干擾生物分子的恢復。

動物組織

新鮮采集的組織可以立即冰凍，并在–20°C、–80°C下，或者液氮中儲存。裂解的組織樣本可在室溫下，在適宜的裂解液中儲存數月。

動物和人體組織也可固定儲存。我們建議您采用酒精和福爾馬林等固定劑；但如果組織在福爾馬林中儲存，會導致DNA出現化學修飾。如果需要從組織中分離DNA，建議不要采用可能會引起交聯反應的固定劑，如鋨酸。此外，還可從石蠟包埋的組織中分離DNA。

動物、酵母和細菌細胞培養

離心處理采集的細胞培養液，吸棄上清液，然后在–20°C或–80°C下儲存細胞。此外，還可準備動物細胞核并在–20°C下儲存。

植物組織

在不影響DNA質量或產量的前提下，大多數植物屬的新鮮葉子和針葉zui多可在4°C下儲存24小時。通常意義上講，如果樣本計劃的儲存時間超出24小時，則應在–80°C下儲存。即便如此，仍有部分樣本（如樹芽）可在4°C下儲存數天。組織在4°C下儲存時，為避免脫水，應避免在密閉的容器內儲存。較大的樣本（如，樹枝）則可儲存在含有一塊濕潤的紙巾的塑料袋中。

如果凍存樣本的方法不符合實際情況，則可采用大量方法干燥植物組織，例如硅膠、食品脫水劑或凍干機(3)。為防止DNA降解，應至少在24小時內使材料*干燥。如需儲存，干燥后的樣本應在黑暗、室溫、干燥或氣密條件下儲存。根據樣本的處理方式，植物標本和法醫學樣本中的DNA可能會存在不同程度的降解。破碎過的植物材料可在室溫下，在適宜的裂解液中儲存數月。

真菌材料

菌絲應直接從培養皿或液體培養液中采集。如從液體培養液中采集，在進行DNA分離和儲存前，應采用離心法沉淀細胞，并吸棄上清液。采集的樣本可以直接冷凍或凍干，并在–80°C下儲存。

基因組DNA提取前的樣本破碎

進行所有的基因組DNA分離步驟前，必須要進行*的細胞壁、細胞質膜以及細胞器的破碎和裂解。破碎不*，會導致產量大幅度減少。

破碎方法

裂解液

破碎通常包括含有去污劑（用于破壞細胞膜）和蛋白酶（用于消化蛋白細胞成分）裂解液的應用。所選的蛋白酶取決于所用的裂解液。為有效裂解，部分樣本需要采取額外處理。

使用轉子-定子勻漿機破碎

根據的樣本粗燥程度，轉子-定子勻漿機可在5–90秒內將動物和植物組織*破碎。轉子以*的轉速旋轉，以湍流和機械式剪切組合作用使樣本破碎。應選用尺寸適當的容器，保持勻漿器探頭浸入，同時將浸入的探頭置于離心管的一側，從而將樣本的泡沫量降至zui小。定子-轉子勻漿機現具有不同的尺寸規格，可采用不同規格的探頭。直徑為5 mm和7 mm的探頭適用于體積不超過300 µl的應用，可在微量離心管中勻漿。直徑為10 mm或更高的探頭則需要更大的離心管。

使用研磨機破碎

采用研磨機破碎時，樣本將在存在研磨珠的情況下高速攪拌。研磨珠與樣本不斷碰撞過程中，剪切并粉碎樣本，同時進行破碎。破碎效果受以下因素影響：

• 研磨珠的大小和成分
• 緩沖液和研磨珠的比率 
• 起始材料的量
• 攪拌器的轉速和配置
• 崩解時間 

細菌zui適宜采用的研磨珠為0.1 mm（平均直徑）的玻璃珠，酵母和單細胞動物細胞zui適宜采用的是0.5 mm的玻璃珠，動物組織zui適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼珠，植物和真菌組織zui適宜采用的是3–7 mm的不銹鋼柱或或碳化鎢珠。必須要采用高濃度硝酸對玻璃珠進行洗滌預處理。此外，也可采用市售的酸洗過的玻璃珠子。所有其它破碎參數則必須根據各種應用，依照經驗確定。

采用研磨皿和研磨棒破碎

如要用傳統研磨皿和研磨棒進行破碎，則應用液氮即時冰凍樣品，并在液氮環境下研磨成細末。將上清液（組織粉末和液氮）移到液氮冷卻的適宜尺寸的試管中，在樣本不融解的情況下讓液氮蒸發。添加裂解液，然后盡可能快速地進入分離操作。

從不同樣本源分離基因組DNA的特別注意事項

部分樣本源中含有可導致DNA分離和分析過程出現問題的物質。在處理此類樣本源時，需要采取特別注意事項。本部分將討論處理一系列樣本源時的注意事項。

血液

我們會定期采集人類血液樣本以供臨床分析應用。血液中含有大量可能干擾下游DNA分析的酶抑制劑。此外，諸如肝素和EDTA等通用抗凝劑還會干擾下游檢測。從血液中分離DNA時，需要具備可提供不含污染物和酶抑制劑的DNA的方法。

在動物體內，鳥類、魚、青蛙的紅細胞（紅血細胞）含有核酸，因而也含有基因組DNA，而哺乳動物的紅細胞中則不含這些成分。由于健康的哺乳動物血液中所含的紅細胞要比含有核酸的白細胞（白血細胞，包括淋巴細胞、單核白細胞和顆粒性白細胞）數量超出近1000倍，在DNA分離之前去除紅細胞可提高DNA產量。為此可結合采用幾種方法。其中的一種方法是選擇性溶解紅細胞：在低滲緩沖液條件下，紅細胞要比白細胞更易低滲休克和快速破裂。另一種方法是Ficoll密度梯度離心法，可回收單核細胞（淋巴細胞和單核細胞）并去除紅細胞。此技術還可去除粒細胞。第三種方法則是通過在室溫下對全血進行3300 x g離心10分鐘，制備全血白細胞富集級分（即所謂的白細胞層）。離心之后，會分成三層：上清層為質粒；中間層為白細胞層；底層含有濃縮的紅細胞。

血液樣本，包括哪些經過紅細胞去除處理的血液樣本，可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。除動物基因組DNA外，也可從血液樣本中分離病毒和細菌DNA。

其它臨床樣本

進行DNA分離時，多數生物液可采用與血液樣本相同的方式進行處理。從糞便樣本中分離DNA較為困難，這是因為糞便中通常含有很多可能降解DNA、抑制下游酶反應的成分。

動物組織和細胞培養液

動物細胞培養液和多數動物組織可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。為幫助裂解，新鮮或凍存的樣本應切成小塊。在裂解前使用勻質機或磨皿和研磨棒進行機械破碎，可縮短裂解時間。骼肌肉、心臟和皮膚組織中含有豐富的收縮蛋白、結締組織和膠原蛋白，為確保能采用蛋白酶或蛋白酶K進行完整消化，在處理這一類組織時要格外小心。

對于固定后的組織，在裂解前應去除固定劑。通過用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌組織，可去除福爾馬林成分。從石蠟包埋的組織中去除石蠟的方法與此類似，即先采用二甲苯提取，然后采用酒精洗滌。

酵母細胞培養液

為消化細胞壁，酵母細胞培養液必須先用溶壁酶或酵母裂解酶進行處理。處理后的去壁酵母細胞將采用離心法進行收集，然后使用裂解液和蛋白酶K或蛋白酶進行裂解。

細菌DNA

很多細菌細胞培養液可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。部分細菌，尤其是革蘭氏陽性菌，則需要采用特殊的酶（例如溶菌酶或溶葡萄球菌酶）進行預孵育以裂解牢固堅固的多層細胞壁。

從大量的臨床樣本中，也可分離出細菌DNA。細菌細胞應從生物液中沉淀下來，并從細菌細胞培養液中分離DNA。在進行細菌細胞離心之前，拭子樣本應采用殺真菌劑進行預處理。

DNA病毒

在臨床應用中，病毒DNA通常（當然不是全部）分離自無細胞的體液，數量非常少。在通過超速離心、超濾或沉淀法DNA分離之前，可能需要對病毒微粒進行濃縮處理。如果預期DNA產量非常低時，在DNA分離過程中，可能還必須要添加載體DNA。制備整合的病毒DNA時，采取的操作步驟與從相關樣本中分離基因組DNA的步驟相同。諸如M13和lambda這一類的噬菌體，分離自感染的培養液。在分離病毒DNA之前，必須通過離心方法從培養液中去除細菌細胞。

植物

從植物材料中分離DNA時面臨著特殊的挑戰，通用的技術往往需要適當調整之后才能用于處理植物樣本。部分植物代謝物具有類似于核酸的化學性質，難以從DNA制備物中去除。純化操作引入的共純化代謝物和污染物（如鹽或苯酚）可能抑制酶促反應或造成分光光度法測定偏差和凝膠移位。

采用在不會誘發高水平植物代謝的條件下生長的植物，通常可以改善DNA分離效果。由于植物之間存在巨大的差異，很難籠統地說明適宜采用的生長條件。但仍有一個基本適用的準則，即在條件允許的情況下，盡量使用健康、年輕的組織。年輕組織的DNA產量通常要高于年老的組織，這是因為年輕組織所含的細胞數量通常要多過同等數量的年老組織。此外，同等重量條件下，年輕組織的代謝量也更少。除此之外，很多“自制”DNA分離方法實驗方案建議在采集前，先使植物在黑暗環境下生長1–2天，以防止積累較高水平的植物代謝物。

DNA處理：良好的實驗室規范

大腸桿菌（E. coli）株系的生長

良好的微生物學技術總是有助于確保*的質粒DNA產量和質量。為在您的質粒制備過程中制備出的細菌培養液，需遵循以下步驟。

1. 通過將來自于新鮮的劃線篩選培養皿中的單個菌落接種到2–10 ml含有適當的抗生素的LB培養基中，制備酵母劑。充分振蕩的(~300 rpm)的情況下，在37°C下生長約8小時。
   小貼士：請勿從已儲存較長時間的甘油菌原液、瓊脂穿刺培養液或培養皿上直接接種，因為這會造成質粒損失或突變。
   小貼士：通常可以在當天方便地生長發酵劑，以便在次日早晨收集過夜生長的較大的培養物。
2. 按照適當的質粒純化實驗方案，將發酵劑按照1/500到1/1000的比例稀釋到較大體積的篩選LB培養基中。
   為確保充分通風，應采用容量至少為培養物體積4倍的燒瓶。請勿使培養物的體積超出了實驗方案建議的體積，否則會造成裂解不充分，降低制備物質量。 
3. 在充分振蕩(~300 rpm)的情況下，讓培養物在37°C下生長12–16小時（參見下一部分說明）。 
4. 接種12–16小時后，采集細菌培養液。這一時刻對應于從對數生到靜止生產期的過渡階段，此時細胞密度較高(3–4 x 10⁹/ml)且細胞內的RNA含量較低。如過早采集，由于細胞密度相對較低，會造成質粒DNA的產量低于預期。如過晚采集，培養液會因過于老化而造成DNA降解，從而使質粒的質量和產量都較低。
   小貼士：培養物的生長依賴于若干因素，如宿主株系、質粒插入和拷貝數以及培養基等等。為確定某個體系的*采集時間，應通過測定OD₆₀₀（參見下一部分說明）來監測細胞密度和培養物生長情況。
5. 采集細菌培養物時，應在4°C下以6000 x g 的速度離心15分鐘。將敞開的離心管倒置，去除所有痕量的上清液，直至培養基已全部倒出。此時余下的細胞即可遵照適當的質粒純化實驗方案，進行裂解操作處理。 
   此外，也可在此時暫停裂解操作處理，將離心獲得的細胞沉淀冷凍保存，之后再進行裂解操作。冷凍的細胞沉淀可在–20°C下保存數周。

大腸桿菌(E. coli)生長曲線

大腸桿菌(E. coli)培養液的生長曲線可分為幾個階段。*階段，遲緩期(lag phase)，直接發生在將發酵劑接種到新鮮培養基中之后。在這一階段，由于細菌仍在適應新鮮培養基，細胞分裂比較緩慢。之后細菌開始更快速地分裂，培養進入對數期(logarithmic (log) phase)（接種之后4–5小時），在這一階段細胞數量呈指數增長。隨著時間推移，培養基內可用的營養物逐漸被消耗，而細菌釋放的代謝物還會細菌生長，培養變為飽和狀態，進入穩定期(stationary phase)（接種后約16小時），在這一階段細胞密度保持恒定。zui后，隨著細胞開始裂解，活性細菌細胞的數量開始下降，DNA出現部分降解，培養進入衰亡期(decline phase)。

大腸桿菌（E. coli）的保存

根據預期的儲存時間，可有多種方法儲存大腸桿菌(E. coli)。甘油菌原液和穿刺培養液均可支持細菌儲存，而瓊脂盤則適于短期儲存。各種方法的準備說明和有益貼士請見下文所述。

甘油原液

大腸桿菌（E. coli）株系可在–70°C下，在15%的甘油原液中儲存數年。

細菌甘油原液的制備方法如下：

1. 向2 ml螺旋小瓶中加入0.15 ml甘油(99%)，然后采用高壓滅菌法進行滅菌。 
   小貼士：儲存滅菌甘油的小瓶可分批準備，并在室溫下儲存備用。
2. 向盛放預先滅菌的甘油的小瓶中添加0.85 ml對數期的大腸桿菌(E. coli)培養液。
3. 充分渦旋振蕩小管，確保細菌培養液和甘油均勻混合。
4. 冰凍在酒精-干冰浴或液氮中，并在–70°C下儲存。 
   小貼士：請勿反復凍融甘油原液，否則會降低細菌活性。
   小貼士：對于較為珍貴的株系，建議分2個原液瓶儲存。
   小貼士：從儲存的株系恢復時，建議在篩選培養平板上對株系劃線，以檢查抗生素標記。

穿刺培養液

大腸桿菌(E. coli)株系還可以穿刺在半固態瓊脂糖中儲存至多1年。穿刺培養用于在實驗室間運輸和遞送細菌株系。

穿刺培養液的準備方法如下：

1. 準備并高壓滅菌LB瓊脂糖（含有0.7%瓊脂糖的標準LB培養基）。
2. 將LB瓊脂糖冷卻到50°C以下（手握的時候感覺到溫度適宜），然后添加適當的抗生素。在瓊脂糖仍處于液態時，在無菌條件下向2 ml螺口小瓶中添加1 ml瓊脂糖，然后等待其凝固。
3. 瓊脂糖小瓶可分批準備，并在室溫下儲存備用。
4. 采用滅菌直絲，從新鮮滅菌培養盤中挑起一片菌落，在半固態瓊脂糖深入穿刺幾次。
5. 保持瓶帽稍稍松動，將小瓶在37°C下孵育8–12小時。
6. 牢牢地密封上小瓶，在黑暗條件下儲存，理想的儲存溫度為4°C。
7. 從儲存的株系恢復時，建議在篩選培養平板上對株系劃線，以檢查抗生素標記。

瓊脂平板

劃線的細菌平板可采用石蠟密封，在4°C下倒置儲存數周。為確保篩選標記不會丟失，務必再含有適當抗生素的平板上進行細菌劃線。

為獲得分離效果良好的菌落，請按如下所述在瓊脂平板上劃線：

1. 用火焰烘烤絲環，然后在空余的無菌瓊脂平板上冷卻。
2. 使用一根絲環，跨過新鮮的瓊脂平板一角在細菌培養液（來自于甘油原液、穿刺培養物或另一平板上的單個菌落）上劃線。 
3. 再次在火焰上烘烤絲環并冷卻。使其穿過*條劃線，然后再次跨過平板的另一角劃線。
4. 重復上述步驟直至形成某種圖案。
5. 在37°C下倒置孵育12–24小時，直至菌落開始發育。

從細菌原液產出液體培養基

圖所示為從儲存的細菌原液獲得進行質粒分離的液體培養液必須采取的步驟順序。在使用前，務必要在篩選平板上對細菌原液進行劃線，以檢查確認它們適宜生長攜帶有適當抗生素抗性的健康菌落。此類原液中可能會含有制備所用培養液引起的突變，或在儲存過程中可能會品質下降。

孵育的液體培養液應來自于健康、分離效果良好的菌落，此類菌落采集自新鮮劃線的篩選平板。這一處理可確保培養液內生長的細胞均出自單個基細胞(founder cell)，具有相同的遺傳組成。

小貼士：體積>10 ml的培養液不可直接自平板孵育，而是應該由2–5 ml的預培養液稀釋1/500到1/1000而得。

質粒規格

根據質粒所含的，決定著控制條件嚴格還是寬松的復制原，質粒在拷貝數方面存在很大的差異（參見下表），同時質粒的大小和相關的插入也存在很大的差異。部分質粒，如pUC系列和衍生物，含有可導致自身在細菌細胞內具有*的拷貝數的突變。基于pBR322的質粒和很多柯斯質粒通常能夠維持在較低的拷貝數。而體積極大的質粒，在每個細胞內通常都維持極低的拷貝數。

細菌培養基和抗生素

液體培養基

大腸桿菌（E. coli）的液態培養液通常可在LB (Luria-Bertani)培養基中生長。但請注意，通常使用的LB培養基有很多種，成分也存在差異。不同的配方含有不同的NaCl濃度，可導致不同的質粒DNA產量。為獲得zui高的質粒DNA產量，我們建議使用表LB培養基中LB組分。

如需配制1升LB培養基，需向950 ml蒸餾水或去離子水中添加10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨以及5 g酵母粉，然后振蕩、攪拌至*溶解。用5 M NaOH將pH調整至7.0。用蒸餾水或去離子水調配溶液體積至1升。等分成小份并高壓滅菌。

小貼士：為避免整個批次集體受到污染，建議在多個小瓶內對液態培養基滅菌，不要在較大的容器內集中滅菌。高壓滅菌后，請勿在24小時內使用培養基，以確保其已正確滅菌，不含污染微生物。

小貼士：從已經過過濾除菌、等分成小份并在–20°C黑暗條件下儲存的抗生素原液中取出的抗生素，應在使用前立即加入到液態培養基中。

培養基滅菌

依照培養基類型、培養基瓶子尺寸和高壓滅菌類型適宜的壓力和滅菌時間，對液態或固態培養基滅菌。

小貼士：為避免培養基在高溫下沸騰，在高壓滅菌前，應在瓶子中注入3/4體積的培養基，同時保持瓶蓋松動。一旦培養基冷卻（降至40°C以下），立即擰緊瓶蓋，讓其*滅菌。

小貼士：抗生素和氨基酸等營養物質將在高壓滅菌器的高溫下滅活。它們應通過孔隙為0.2 µm的過濾裝置過濾滅菌，之后再添加到從妥善儲存的原液中取出后的已冷卻、高壓滅菌的培養基中。

固體培養基

E. coli 通常在含有1.5%瓊脂糖和適當抗生素的LB平板上劃線和儲存。

制備：依照液態培養基部分給定的組分配制LB培養基。在臨高壓滅菌前，每升中加入15 g瓊脂糖并攪拌混合。高壓滅菌之后，輕輕地渦旋培養基，以便將融化的瓊脂糖均勻地分散到溶液中。應特別小心高溫液體在渦旋時出現沸騰。

小貼士：將高壓滅菌的瓊脂糖培養基冷卻到50°C以下（手握時感到溫度適宜），然后再添加對溫度敏感的抗生素和營養物質。在傾倒前*混合，以使整個培養基具有均勻的濃度。

小貼士：在層流罩內傾倒平板，如果無層流罩，則可在臨近本生燈的清潔試驗臺面上進行傾倒。每個標準90 mm細菌培養皿中使用30–35 ml培養基（每升培養基大約對應于30個平板）。

傾倒過平板后，通過使用本生燈火焰在表面快速略過，去除氣泡。切勿讓火焰在某處逗留，否則可能造成平板切片內的抗生素遭破壞。

在凝固之后或者臨使用之前，取下帽蓋并將平板立在層流罩內1小時，直接干燥平板。此外，如果您手上沒有層流罩，則可輕微開啟平板蓋，于37°C下在培養箱中干燥平板30分鐘，或蓋上蓋子在室溫下倒置放置2–3天。

小貼士：為保持對光線明暗的抗生素的活性，可將平板倒置，在4°C黑暗條件下儲存，或者將平板卷在鋁箔紙中。存儲時間請勿超過3個月，因為這會造成抗生素降解。

抗生素

對于具有抗生素篩選標記的質粒或基因，攜帶這些質粒或基因的細菌株系應在含有篩選劑的液態或固態培養基中培養。缺少抗生素篩選劑，會造成帶有遺傳標記的質粒丟失，并可能篩選出快速生長的突變！

小貼士：通過經過過濾滅菌的各批次液態或固態培養基分別制備抗生素原液，均分并在–20°C黑暗條件下儲存。常用抗生素建議的儲存和工作濃度如下表所示。

小貼士：在剛剛高壓滅菌的培養基中添加抗生素之前，請確保培養基已冷卻到50°C以下。

裂解細菌細胞以進行質粒純化

由于DNA產量和質量取決于用于純化的細胞裂解產物質量，在質粒分離過程中，裂解細菌細胞是非常重要的一個步驟。

堿裂解

堿裂解是質粒純化之前(4, 5)zui常用的細菌細胞裂解方法。堿裂解過程涉及四個基本步驟。

1. 在含有RNase A酶的Tris•Cl–EDTA緩沖液中重懸采集的細菌細胞。 
   小貼士：為確保有zui大數量的細胞暴露在裂解試劑下，請確保重懸充分，無細胞抱團。 
   小貼士：如需大規模純化低拷貝數質粒（需要使用較大體積的培養液），則為了提高堿裂解效率進而提升DNA產量，適當增大裂解液的體積較為有益。
2. 使用NaOH/SDS裂解細胞。十二烷基硫酸鈉(SDS)可使細胞膜的磷脂和蛋白質成分溶解，從而使細胞成分裂解并釋放。NaOH可以滅活染色體和質粒DNA，以及蛋白質。RNase A酶的存在，則可確保裂解過程中，解離的胞內RNA能夠得以消化。 
   小貼士：如果在添加了裂解液(NaOH/SDS)之后，溶液變得非常粘稠、難以攪拌，則表示溶解步驟中存在過多的生物量。這會造成細胞裂解不充分，建議將所用的裂解液和中和液量加倍。 
   小貼士：注意避免劇烈地攪動或渦旋振蕩裂解液，因為這會對細菌染色體造成剪切作用，進而與質粒DNA共純化。應輕輕地，而非將裂解試管倒置的方式攪動溶液，反復4–6次。 
   小貼士：請勿讓裂解液處理的時間超過5分鐘。這樣做既能確保質粒DNA得到的釋放，同時又能避免不可逆的質粒降解。
3. 通過添加中和裂解液。注：高鹽度會造成十二烷基硫酸鉀(KDS)沉淀，且變性的蛋白質、染色體DNA和細胞細胞碎片共沉淀在不溶的鹽洗滌劑復合物中。質粒DNA（環狀和共價閉合形式）正確復性，并保留在溶液中。 
   小貼士：通過使用冷凍的中和液和在冰上孵育，可增強沉淀效果。
4. 通過離心或過濾方法，清洗裂解產物，沉淀出殘渣。 
   注：傳統的做法是，來自于清洗后的細菌裂解液的質粒DNA的純化，采用氯化銫(CsCl)超純法進行純化。目前，市面上銷售有大量的商業質粒純化試劑盒，可藉此完成各種通量要求和應用需要的純化操作。

其它裂解方法

我們介紹了大量細菌細胞裂解的其它方法(1, 6)。其中的部分方法是針對其他應用開發的，并不適用于質粒DNA制備。

• 煮沸裂解法：細菌細胞采用溶酶體來處理，以弱化細胞壁，然后通過在沸水中水浴約1分鐘加熱裂解細胞。
• 去污劑裂解：細菌細胞通過離子去污劑（例如，SDS）或非離子去污劑（例如，Triton X-100）處理的方式進行裂解。
• 機械裂解：細菌細胞通過機械式破碎作用裂解（例如，通過超聲波處理）。 
• 酶促消化：有些裂解方法包括了采用酶（用于幫助弱化細胞壁）進行的細菌處理步驟。 

大腸桿菌（E. coli）之外的細菌的裂解

從大腸桿菌（E. coli）之外的細菌中分離質粒DNA時，為優化特定種屬的裂解條件，通常需要修改裂解步驟。

DNA的轉化

制備感受態E. coli

具有（從各類來源）回收DNA能力的細胞被稱為“感受態”細胞。現有多項技術可制備感受態細胞，其中的的一項制備感受態大腸桿菌(E. coli)的技術如下。

注：采用這一實驗方案制備的細胞不宜用作電穿孔實驗。

所需材料

• 儲存在甘油原液瓶中的E. coli
• LB培養基
• LB瓊脂糖平板
• 適當的篩選抗生素
• TFB1緩沖液（參見表Buffer TFB1）
• TFB2緩沖液（參見表Buffer TFB2）

1. 通過一根滅菌的牙簽或接種環從甘油原液瓶中取出痕量的大腸桿菌(E. coli)細胞，將其接種到含有適當濃度的相關篩選抗生素的LB瓊脂糖平板上。如果宿主株系已經過培養并儲存在2–8°C下（在保證活性和存活力無大幅下降的前提下，培養物zui多2–8°C條件下儲存3個月），則請從此類原液中挑出細菌。
2. 在37°C下孵育過夜。
3. 取一種菌落，接種到含有相關抗生素的10 ml LB培養基中。在37°C下生長過夜。
4. 將1 ml過夜的培養物添加到100 ml含有相關抗生素的預熱LB培養基中，然后放入500 ml搖瓶中，在37°C條件下振蕩，直至OD₆₀₀達到0.5（約需要90–120分鐘）。
5. 在冰上冷卻培養物5分鐘，然后將培養物轉移到無菌、圓底的離心管中。
6. 低速離心收集細胞（時長5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。
7. 小心地吸棄上清液。將細胞一直置于冰上。
8. 在冰冷的(4°C) TFB1緩沖液（30 ml，適于100 ml培養物）中輕輕地重懸細胞，然后將懸液在冰上再置于冰上90分鐘。
9. 離心收集細胞（時長5分鐘，速度4000 x g，溫度4°C）。 
10. 小心地吸棄上清液。將細胞一直置于冰上。
11. 在4 ml冰冷的TFB2緩沖液中小心地重懸細胞。
12. 在無菌的微量離心管中制備成100–200 µl等份，在液氮或干冰-酒精混合液中冷凍。在–70°C下儲存感受態細胞。

轉化感受態E. coli

轉化是將質粒DNA引入細菌宿主細胞的過程。有多種方法可供轉化細菌細胞，其中的一種方法如下。

• 感受態大腸桿菌(E. coli)細胞 
• SOC培養基
• LB瓊脂糖平板

1. 將一份準備轉染的等份DNA（10 µl或更少）轉移到冰冷、滅菌的1.5 ml微量離心管中，將其置于冰上。
2. 解凍放在冰上的一等份冰凍的感受態大腸桿菌(E. coli)細胞。 
3. 輕輕地重懸細胞，然后轉移100 µl細胞懸液到含有質粒DNA的微量離心管中，小心地混合，然后置于冰上約20分鐘。
4. 將離心管移到42°C水浴或恒溫槽中放置90秒。 
5. 向細胞中添加500 µl SOC培養基，在37°C下孵育60–90分鐘。 
   小貼士：振蕩可提升轉化效率。
6. 在含有相關抗生素的LB瓊脂糖平板中鋪盤成50、100和200 µl等份。在37°C下過夜孵育平板，直至菌落生長成型。 

陽性對照檢查轉化效率

采用1 ng含有抗抗生素基因的參比基因轉化感受態細胞。鋪盤到含有相關抗生素的LB瓊脂糖平板上。比較采用對照質粒獲得的菌落數量和采用感興趣的質粒獲得的菌落數量，進而比較轉化效率。

陰性對照檢查抗生素活性

在含有相關抗生素的單個LB瓊脂糖平板中鋪盤至少200 µl的轉化混合物。平板上沒有菌落則表示抗生素具有活性。

異丙醇沉淀DNA

乙醇沉淀法是常用的核酸濃縮、脫鹽和恢復方法。沉淀由高濃度的鹽和附加的異丙醇或乙醇成分介導。異丙醇沉淀法所需的乙醇量較少，因而成為了大批量DNA沉淀的首先方法。此外，異丙醇沉淀法可在室溫下進行，可zui大限度減少感染下游應用的鹽共沉淀現象。

1. 采用醋酸鈉（0.3 M，pH 5.2，終濃度）或醋酸銨（2.0–2.5 M，終濃度）等，視必要調節鹽濃度。
2. 向DNA溶液中添加0.6–0.7體積的室溫異丙醇，然后充分混合。
   小貼士：請在室溫下使用所有溶液，以便zui大限度減少鹽共沉淀現象。 
   小貼士：請勿使用聚碳酸酯試管進行沉淀，因為聚碳酸酯無耐異丙醇腐蝕能力。
3. 立即在4°C下以10,000–15,000 x g的速度離心樣本15–30分鐘。 
   小貼士：應在4°C下離心，以防止樣本過熱。（小量沉淀時，可在室溫下離心。） 
   小貼士：也可在添加異丙醇后，使用玻璃棒，通過DNA螺旋化沉淀基因組DNA。螺旋化的DNA應立即轉移到含有適當的緩沖液微量離心管中，然后再溶解（參見步驟9）。 
4. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
   小貼士：在離心之前在試管外側做出標記，可更輕松地確定不同的沉淀。異丙醇沉淀法的沉淀具有玻璃光澤外觀，相對于通過乙醇沉淀法獲得的蓬松的含鹽沉淀，更難以看到。
   小貼士：去除上清液時需小心處理，這是因為異丙醇沉淀法獲得的沉淀會更疏松地粘附在試管一側。 
   小貼士：使沉淀處于上方，小心地傾倒試管，以免沉淀移動。
   小貼士：對于較為珍貴的樣本，可保留上清液，直至已驗證過沉淀DNA的恢復。 
5. 添加1–10 ml（具體取決于制備規格）室溫的70%乙醇，洗滌DNA沉淀。此步驟可去除共沉淀鹽，并用更具揮發性的乙醇代替異丙醇，讓DNA更易溶解。 
6. 在4°C下，以10,000–15,000 x g的速度下離心5–15分鐘。 
   小貼士：按照與之前的處理相同的方向離心試管，以便將DNA回收成緊湊的沉淀小球。
7. 在不破碎沉淀的前提下，小心地倒出上清液。  
8. 風干沉淀5–20分鐘（具體取決于沉淀的尺寸）。 
   小貼士：請勿過度風干沉淀（例如使用真空蒸發器），因為這會造成DNA，尤其是高分子DNA難以溶解。
9. 在適宜的緩沖液中重新溶解DNA。  
   小貼士：根據預期的DNA產量和所需的zui終DNA濃度，選擇適當體積的緩沖液。  
   小貼士：請使用pH為7.5–8.0的緩沖液，因為DNA不易在酸性緩沖液中溶解。（如采用水，則請核實其pH值。） 
   小貼士：請沖洗試管壁以回收全部的DNA，尤其是在使用玻璃試管時。為避免DNA剪切作用，請勿移液或渦旋。 
   小貼士：為避免出現剪切作用，應非常溫和地再溶解高分子DNA（如基因組DNA），例如室溫下過夜，或者55°C下輕輕攪動溶解1–2小時。

儲存DNA

純化的DNA應在–20°C或–70°C下，在弱堿性環境（例如，pH 8.0的Tris?Cl或者TE緩沖液；參見表 1 mM Tris·Cl和TE緩沖液），因為酸性條件可造成DNA水解。請勿反復凍融，因為這會造成DNA沉淀。

稀釋后的核酸溶液（例如，用作標準品的倍比稀釋系列）應分成等份儲存（如有可能，請儲存在硅膠管中），并僅融解一次。這種處理可避免核酸吸附在試管壁上，從而造成溶液中的核酸濃度下降。

內毒素及其注意事項

何為內毒素？

內毒素又名lipopolysaccharides或LPS，是革蘭氏陰性細菌（例如，大腸桿菌(E. coli)）的細胞膜成分。細胞膜外膜的外層脂質部分全部由內毒素分子組成。一個大腸桿菌(E. coli)細胞約含有2百萬個LPS分子，而每個LPS分子又包含一個疏水脂質A部分、一個糖殘基復合物陣列，以及一個帶負電的磷酸鹽基團。因此，每個內毒素分子處理疏水、親水和帶電的區域，使其具備了與其他分子相互作用的*功能。細菌積極生長過程中會向周圍的環境排出少量的內毒素，而在其死亡時則會一次性釋放大量內毒素。為制備質粒而裂解細菌細胞時，內毒素分子從細胞外膜釋放到裂解液中。

內毒素能夠大幅降低內毒素敏感細胞系的轉染效率。此外，在轉染試驗中，內毒素還會和DNA競爭“游離”的轉染試劑，影響質粒DNA的回收。總而言之，內毒素代表了轉染試驗設計中的一種不可控變量。它們在瓊脂糖凝膠中不可見，無法通過光密度法檢測出來，且會影響試驗結果和結果的可重現性，使您難以對結果進行比對和解釋。

不同質粒制備方法的內毒素污染

內毒素分子的化學結構和性質，以及其易于形成膠束的趨向，都使其可以與質粒DNA共純化。例如，在CsCl超速離心法中，CsCl分帶的DNA易受內毒素分子污染，在CsCl中，內毒素分子具有與質粒-溴化乙錠復合物類似的密度。

在尺寸排阻樹脂中，內毒素組成的膠束尺寸較大，會使內毒素分子的行為表現類似于DNA大分子，在陰離子交換色譜柱中，內毒素上存在的負電荷可與陰離子交換樹脂相互作用，導致內毒素和質粒DNA共純化。

即便如此，質粒DNA中存在的內毒素污染水平仍然依賴于所選用的純化方法。

如何測定內毒素？

傳統的做法是，通過內毒素和海鱟(Limulus polyphemus)的阿米巴樣細胞凝固蛋白之間的凝聚反應來測定內毒素。

如今則采用靈敏度高得多的光度測定法（例如，BioWhittaker, Inc.的Kinetic-QCL測定），該法基于鱟阿米巴樣細胞溶解物(LAL)和合成生色底物。LPS污染程度通常以內毒素單位(EU)來表示。通常情況下，1 ng LPS對應于1–10 EU。

內毒素對生物應用的影響

內毒素會大幅影響DNA轉染進原代細胞核敏感培養的細胞，較高的內毒素水平還會顯著降低沾染效率。此外，在基因療法應用中采用不含內毒素的質粒DNA也非常重要，這是因為內毒素會引起動物和人發燒、內毒素休克綜合征、以及補體級聯激活等臨床癥狀。

內毒素還會通過免疫反應非特異性激活，干擾體外轉染進哺乳動物細胞（例如巨噬細胞和B細胞）。此類反應包括免疫介導物（例如，IL-1和前列腺素）的誘導合成。為避免誤讀實驗結果，確保塑料器皿、培養基、血清和質粒DNA不含LPS污染物非常重要。

不含內毒素的塑料和玻璃器皿

為避免在初次內毒素去除之后質粒DNA被二度污染，建議僅使用經認證不含致熱源、不含內毒素的新塑料制品。不含內毒素、不含致熱源的塑料制品可自很多供應商處購買。

內毒素對玻璃制品具有較強的吸附性，在洗滌時難以*清除。標準的實驗室高壓滅菌操作對內毒素水平無影響或者影響很小。此外，如果之前已采用高壓滅菌設備處理過細菌，玻璃制品會受到內毒素分子過渡污染。為*殺滅粘附的內毒素分子，建議在180°C下過夜加熱玻璃制品。

此外，使用不含內毒素的試劑，避免純化的不含內毒素DNA不受二度污染非常重要。

定量DNA

對于很多分子生物學應用，可靠測定DNA濃度非常重要。分光光度測定法和熒光測定法是常用的基因組和質粒DNA濃度測定方法。分光光度測定法可用于測定微克量級的純DNA樣本（即，不受蛋白質、苯酚、瓊脂糖或RNA污染的DNA）。熒光測定法更敏感，可測定納克量級的DNA，此外使用Hoechst 33258染料可以對DNA進行特異性分析。

分光光度測定法

可通過在石英分光比色液槽中，用分光光度計測定260 nm (A₂₆₀)下的吸光度來測定DNA濃度。為確保zui高的精度，讀數應處于0.1和1.0之間。260 nm處1單位的吸光度，對應于每ml內50 µg基因組DNA（A₂₆₀ =1對應于50 µg/ml；基于標準的1 cm通道長度。這一關系僅在中性PH下測定時有效，因此樣品應采用中性PH的低鹽緩沖液（例如，pH 7.0的Tris•Cl）稀釋。

處理少量DNA時，諸如使用純化后的PCR產物或提取自瓊脂糖凝膠的DNA片段，通過瓊脂糖凝膠分析定量將更有效。

小貼士：如果您使用多個比色皿測定多個樣本，所用的各個比色皿必須相匹配。

小貼士：分光光度法測定并不區分DNA和RNA，因此RNA污染物會造成估算出的DNA濃度虛高。

小貼士：苯酚具有zui高270–275 nm的吸光范圍，與DNA的吸光范圍比較接近。苯酚污染物會造成虛假的高產量和高純度，這是因為A₂₆₀值出現上調。

溶劑對分光光度計讀數的影響

核酸的吸光度取決于溶解核酸所用的溶劑(7)。使用低鹽度緩沖液時，A₂₆₀數值可重現，但如果使用水，則不可實現。由于空氣中CO2溶解而引起的水PH值變化時，很可能出現這種情況。在水中測定的A₂₆₀/A₂₈₀比率也會引起讀數（參見溶劑對A₂₆₀/A₂₈₀比率的影響）出現較大波動，通常獲得的比率<1.8，這會造成對蛋白污染物的敏感度下降(7)。相反，在低鹽、弱堿性PH值的緩沖液下測得的A₂₆₀/A₂₈₀比率通常是可重現的。

RNA污染對分光光度讀數的影響

根據所使用的DNA分離方法，RNA將與基因組DNA共同純化。RNA可能會抑制一些下游的應用，但它不會抑制PCR。分光光度法測量不能分辨DNA和RNA，所以RNA的污染可導致DNA濃度被高估。雖然不能被有效地定量檢測，RNA污染有時仍可以通過瓊脂糖凝膠電泳分析配合常規溴化乙錠染色進行檢測。RNA條帶出現模糊和污染，并且只在≥25-30 ng可以被檢測到（RNA：DNA的比例為0.5:1 ）。

RNase A處理將去除被污染的RNA，這可以合并到純化步驟中或在DNA被純化后進行。在使用之前，為了破壞任何可能存在的DNase活性污染，請確保RNase A的溶液已經被熱處理過。或者，使用從一個可靠的供應商處購買的去DNase的RNase。

質粒DNA的RNA污染取決于質粒的制備方法。使用堿裂解與苯酚抽提的方法不能從質粒DNA中分離出RNA，從而導致高水平的RNA污染。的陰離子交換技術可以分離高分子量的不含RNA的基因組DNA。

DNA的純度

在260 nm和280 nm處的讀數比值（A₂₆₀/A₂₈₀）提供了相對于吸收紫外光污染物（如蛋白質）的DNA純度估計值。A₂₆₀/A₂₈₀比值受pH值影響顯著。由于沒有緩沖作用，pH值和由此產生的A₂₆₀/A₂₈₀比值可以變化很大。較低的pH值會導致較低的A₂₆₀/A₂₈₀比值，同時降低對蛋白質污染的敏感性（7）。為獲得的A₂₆₀/A₂₈₀值，我們建議在微堿性緩沖液中測量吸光度（如10 mM Tris•Cl, pH 7.5）。一定要使用適當的緩沖液對分光光度計較零。

純DNA A₂₆₀/A₂₈₀比值為1.7–1.9。在220–320 nm之間掃描吸光度，將顯示在260 nm處是否有污染物影響吸光度。吸光度掃描曲線應該在260 nm出現峰值并且整體平滑。

熒光分析法

熒光分析法通過使用熒光染料可以對DNA濃度進行特異性、靈敏的測定，其可采用包括Hoechst染料和PicoGreen在內的常見染料。

Hoechst3258對RNA的親和力較小，可以定量被RNA污染的DNA樣品。這表明與DNA結合后在458 nm熒光值增加。DNA標準品和樣品與Hoechst33258混合，使用掃描型熒光分光光度計或濾波器熒光計在365 nm激發波長和460 nm發射波長在玻璃或丙烯酸比色皿中測定。樣品測量結果與標準品進行比較，以確定DNA濃度。

小貼士：因為Hoechst33258優先與AT富集的DNA結合，請使用與DNA樣品具有類似堿基組成的標準品。

PicoGreen測定法對dsDNA高度敏感，可以在200 µl體積中測量低至20 pg的dsDNA。其實，從500 pg/ml到500 ng/ml濃度的DNA都可以使用單一濃度的染料測定。該測定已經過優化，可zui大限度減少RNA和ssDNA的熒光值，使得dsDNA可以在等摩爾濃度的ssDNA和RNA存在的情況下定量，并zui大限度減少二者定量結果的影響。

瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠電泳分析能夠快速而簡單地定量檢測DNA，特別是小DNA片段（如PCR產物）。少至20 ng的DNA都可通過瓊脂糖凝膠電泳配合溴化乙錠染色進行檢測。在瓊脂糖凝膠上，DNA樣品是在已知量的相同或類似大小DNA的旁邊進行電泳。加樣的樣品DNA的量可通過可視化或成像系統掃描其條帶強度與標準品的對比來估計。標準品的片段大小請務必與目的基因大致相同，以確保DNA含量評估的可靠性，因為較大片段比小片段更易螯合染料，形成更強的條帶強度。

更的瓊脂糖凝膠定量可以通過密度計分辨條帶強度，并與使用已知濃度的DNA所產生的標準曲線進行比較。大多數實驗中的有效密度定量范圍在20–100 ng之間。

小貼士：用于密度定量的DNA量應落在標準曲線的線性范圍內。

有關瓊脂糖凝膠電泳更多的信息請見使用凝膠分析DNA 。

DNA的限制性內切酶消化

限制性內切酶消化原理

許多應用都需要使用限制性內切酶將gDNA轉換為大小適宜的片段。這一處理可獲得大小適宜、利于下游操作的DNA片段。限制性內切酶是一種可以在特異性靶序列內結合和剪切DNA的細菌酶。II型限制性內切酶是分子生物學中zui廣泛使用的工具。它們在特異性識別位點結合DNA，其中包括一個短回文序列，并且在該位點內裂解，例如，AGCT（用于AluI）中，GAATTC（ 用于EcoRI）等。同裂酶是一種不同的酶，他們具有相同的特異性，并在某些情況下還具有相同的剪切類型。

小貼士：同裂酶屬性可能略有不同，這點非常有用。例如，MboI和Sau3A酶具有相同的序列特異性，但MboI不剪切甲基化DNA，而Sau3A可以。因此，在需要的時候，Sau3A可以用來代替MboI。

選擇合適的限制性內切酶

選擇合適的限制性內切酶時需要考慮以下幾個因素：

• 片段大小
• 甲基化敏感性
• 平端/粘性末端片段
• 反應條件的相容性（使用一個以上的酶時）

片段大小

限制性內切酶具有較短的識別序列并且比那些具有較長識別序列的酶剪切的更為頻繁。例如，一個4堿基對（bp）的剪切酶平均剪切4⁴（256）個堿基，而一個6 bp的剪切酶平均剪切4⁶（4096）個堿基。

小貼士：定位基因組DNA或YAC、BAC或者P1可使用6 bp剪切酶，因為這些酶剪切片段的大小范圍適合于克隆。

甲基化

許多有機體具有一種被稱為甲基化酶的酶，可以在特定序列將DNA甲基化。當位點被甲基化后，不是所有的限制性內切酶都能剪切其識別的位點。因此，限制性內切酶的選擇受其對甲基化敏感性的影響。此外，甲基化模式在不同的物種間具有差異，這也影響到限制性內切酶的選擇。

• 與概率預期相比，CpG二核苷酸在哺乳動物DNA中發生甲基化大約減少5倍量，如果胞嘧啶被甲基化，則大多數限制性內切酶在CpG二核苷酸識別位點無法剪切。因此，許多酶在CpG的識別位點，如 EagI、NotI和SalI很少剪切哺乳動物DNA。
• 果蠅、線蟲和其它一些物種不具有甲基化的DNA，并其CpG二核苷酸的含量比例高于哺乳動物。因此Rare剪切酶在這些物種中的剪切更加頻繁。
• 植物的DNA是高度甲基化的，所以為了在植物中成功定位，所選擇的酶要么在其識別位點不含有CpG二核苷酸（例如DraI或SspI），要么可以剪切甲基化的CpG二核苷酸（例如，BamHI、KpnI或者TaqI）。

小貼士：細菌和真核生物之間的甲基化類型不同，所以克隆和非克隆DNA的限制帶型可能會有所不同。

小貼士：不同真核生物之間的甲基化類型也不同（見以上圖表），并影響構建基因組DNA文庫的限制性內切酶的選擇。

平端/粘性末端片段

有些限制性內切酶剪切識別位點的中段，產生平端的DNA片段。然而，大多數酶的剪切交錯在每條鏈上，導致在每個片段的末端出現含有數個堿基對的單鏈DNA，被稱為“粘性”末端。有些酶剪切出5'突出端而其他一些則剪切出3'突出端。剪切的類型會影響下游克隆的難易：

• 粘性末端片段可以輕易連接到具有單鏈突出端的其他片段的粘性末端，從而產生的克隆。
• 平末端片段的連接效率通常要少得多，使得其克隆更加困難。然而，任何平端片段可以與任何其他的平端相連接，所以當不能生成親和的粘性末端片段時，就要使用平端剪切酶，例如，如果載體的多接頭位點不含有被克隆片段的酶親和位點。

反應條件的相容性

如果使用一種以上的酶對DNA片段進行剪切，這兩種酶可以同時添加到反應中，前提是它們在相同的緩沖液中活性相同并可在同一溫度下進行反應。如果酶不具有親和的反應條件，有必要對反應產物進行剪切、純化，然后進行第二次剪切。

限制性剪切成分

• 水
• DNA
• 緩沖液
• 酶

剪切的DNA量依賴于下游應用和被分析生物的基因組大小。我們建議哺乳動物和植物基因組DNA蛋白印跡法每次反應使用至少10 µg的DNA。為了定位克隆DNA，每個反應0.2–1 µg DNA足夠。

小貼士： DNA應無苯酚、氯仿、乙醇，洗滌劑或鹽等污染，因為這些污染物可能對限制性內切酶活性造成干擾。

一單位的限制性內切酶在1小時內可以*剪切1 µg底物DNA。然而，超螺旋質粒DNA通常需要超過1個單位/µg的酶才能被*剪切。為了確保*剪切，大多數研究人員加入10倍過量的限制酶確保*反應。

小貼士：請確保限制性內切酶不超過總反應體積的10％，否則承載酶的甘油可能會抑制剪切。

反應體積

大多數剪切是在10–50 µl的體積中進行。（反應體積小于10 µl易受移液誤差影響，不使用。）

限制性酶切準備

1. 將反應組分移液到皮氏管中并用移液槍拌勻。
   小貼士：*混合非常重要。
   小貼士：酶應保持在冰上并在zui后添加。 
   小貼士：當準備大量的剪切反應，用緩沖液和酶配制反應預混液，并等分到含有被剪切DNA的皮氏管中。
2. 短暫離心后收集底部的液體。
3. 使用水浴或加熱模塊在37℃孵育剪切反應，通常需要1-4小時。然而一些限制性內切酶需要更高的孵育溫度（如50–65℃），而其他則要求較低的（如25℃）孵育溫度。
4. 對于一些下游應用，有必要在剪切反應后熱滅活酶。剪切反應后加熱至65℃保持20分鐘，滅活大多數*孵育溫度為37℃的酶。注意，某些限制性內切酶并不能*被熱處理滅活。