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傳統的熒光定量PCR,經過多年的發展,已是很成熟的實驗方案了。其中,zui常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在這二種方法當中,Taqman法又以其特異性高、定量,得到廣大用戶的認可。
但是Taqman法PCR,它還是一個相對定量的辦法。它測的是一個Ct值,也就是PCR到第幾個循環,熒光強度達到了一個設定值。
要想用Taqman方法得到:樣本中到底有幾個目標基因的拷貝,那么還是要再做一個標準品的(qPCR)曲線。才能知道樣本的Ct值落在標準曲線的哪個位置上。再進一步推算出樣本中的拷貝數量。
這樣做,它首先要做一個標準曲線,那么,當然它就增加了工作量。另一方面,因為引入了標準品,而標準品也多少是有一定誤差的。所以,實驗中又多引入了一個實驗的誤差變量。
科學家為了克服傳統定量PCR的上述兩個弱點,那么又新發明了微滴數字PCR。
微滴數字PCR的原理,就是把原來一整管的PCR反應液,分散成幾萬個,甚至幾百萬個極微小的液滴。這些小微滴同時進行PCR反應,這樣就可以計算出原來的反應液當中,有多少個目標基因的拷貝了。
了解了原理之后,我們來看看商業公司的實現方案。其中Bio-Rad公司和RainDance公司采用了油包水PCR的方法,用油把PCR反應液分隔成等體積的小液滴,再進行PCR反應。Life公司采用了芯片的方法,在芯片上預制了2萬個小孔,把PCR反應液,物理地注入到芯片上的小孔中,密封后,進行PCR反應。
在本期的課程當中,我們將以Bio-Rad公司的儀器和方法為例,來介紹ddPCR。
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