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干擾素的制備及檢測實驗介紹
實驗原理
干抗素是干擾素誘生劑作用于有關生物細胞所產生的一類高活性、多功能蛋白質。它從細胞產生和釋放出來以后,又作用于相應的其它同種細胞,使其獲得抗病毒及抗腫瘤等多方面的免疫力。
所謂干擾素誘生劑,是指能誘導有關生物細胞產生干擾素的一類物質。能誘導有關生物細胞產生α和β干擾素者稱甲類干擾素誘生劑,如各種動物病毒、細胞內寄生的微生物等;可誘導T細胞產生γ干擾素的稱為乙類干擾素誘生劑,如脂多糖、鏈球菌毒素、腸毒素A等。
在實際工作中,制備干擾素多采用兩種方法。一是用干擾素誘生劑誘導某些生物細胞產生干擾素,經提取純化并檢定合格后即可使用。該法所用的細胞多為外周血白細胞。二是采用基因工程法進行生產,即將干擾素基因導入大腸桿菌內,通過培養大腸桿菌來生產干擾素。目前,大規模生產干擾素主要采用基因工程法。
實驗設備
細胞培養設備(如培養瓶、多孔培養板、溫箱、顯微鏡、旋轉培養器等)、水浴箱等。
實驗步驟
1. 制備誘生劑:采用NDVF系弱毒株,以雞胚尿囊液形式保存于-20℃,
其血凝滴度穩定在1:640~1:1 280之間。大量繁殖時,用0.5%水解乳蛋白稀釋100~1 000倍,接種于9日齡雞胚尿囊腔,置37℃培養72h后,收獲尿囊液,效價測定應大于1:640,無菌檢查應合格。
2. 制備誘生細胞:無菌采取人外周血(多用人臍帶血,或血庫貯藏血),置于含肝素的無菌瓶內,于4℃保存不超過24h,誘生細胞(白細胞)不單獨提取,以全血代替。
3. 制備粗制干擾素:
1) 加誘生劑,按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液,其血凝滴度不低于1:640);
2) 加溫吸附,將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h,每隔15min晃動一次,使NDVF吸附于白細胞上。然后以1000r/min離心20min,棄上清,留沉淀物;
3) 加營養液孵育誘生,按抗凝全血的1~2倍量加Eagle營養液于上述沉淀物中,混勻,置35~36℃溫箱內旋轉培養18~20h;
4) 離心及酸處理,將上述培養物以2000r/min離心30min,取上清,以6mol/L鹽酸將其pH值調至2.0,置4℃冰箱5天滅活NDV;
5) 中性化,經5天酸化后,再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調至7.2~7.4,即為粗制干擾素。
4. 制備精品干擾素:
1) KCNS沉淀,取上述粗制干擾素,加KCNS并用2mol/L HCl調pH值為3.5,然后以2 000r/min離心30min取沉淀;
2) 酒精提取,將沉淀溶于95%酒精(預冷至-20℃),用2mol/L NaOH調pH值為4.2,以2 000r/min離心30min取上清;用2mol/L HCl調pH值至3.5,離心后取上清,再將pH值調至5.6,離心后取上清,zui后將pH值調至7.1,離心后取沉淀;
3) 過碘酸鈉沉淀,將沉淀溶于PBS中,加過碘酸鈉,并調pH值為4.5,用50%乙醇10倍稀釋,離心后取上清,將上清液對0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析過夜。
4) sephacryl S200柱層析:將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4~5×100cm柱),用PBS平衡后,加樣(即上述上清液),用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續檢測,收集相應峰即為精制干擾素。取樣進行效價測定,按結果進行稀釋,分裝并凍干。
5. 檢定
1) 效價測定
a. 制備攻擊病毒:將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細胞上傳代后,
再在豬細胞(IBRS)上傳3~5代,使其對IBRS有良好致病效應,其TCID50應穩定(一般在10-6~10-7之間)。
b. 準備測定細胞:生長良好的幼齡IBRS單層細胞。
c. 測定:取上述單層細胞分為若干組,每組加不同稀釋度的干擾素,置37℃孵育20~24h,然后每管均用100個TCID50的VSV攻擊,置37℃ 48~72h孵育后,觀察結果。同時設細胞對照組和病毒對照組。病毒對照組CPE>75%,正常細胞對照組CPE=0,即認為該測定系統有效。干擾素判定標準是以能保護半數細胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數作為干擾素的單位。
2) 酸堿度測定
取本品10支,加水溶解,精密測量pH值應為6.0~7.5。
3) 水分測定
按磺硫溶液法測定,不得超過3%。
4) 安全試驗
取本品加水溶解,小鼠尾靜脈注射,48h內不得有死亡。
5) 熱原檢查
取本品1支,加水溶解,依法檢查,應符合規定。
6) 菌檢
取本品3支,無菌水溶解,分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養基上,37℃培養1周,應無菌生長。
7) 超敏反應
取健康豚鼠6只,每只腹腔注射本品適量,連續3次,于20天后再于耳靜泳注入本品適量,應無過敏反應現象發生。
注意事項
1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時,種毒應無菌檢查合格,且滴度在1:640以上。收毒時,應將污染的雞胚棄去。
2. 不必從血液中將白細胞提取出來,因紅細胞對白細胞產生干擾素有營養作用。純化的白細胞產生干擾素效價不一定高。
3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV,而在pH值20時,干擾素是穩定的。
4. 在常溫下干擾素半衰期很短。故各種操作要在低溫環境下進行,動作要迅速,純化所用試劑要作預冷處理。干擾素粗品及精品要及時置低溫下存放。效價測定時,干擾素應于臨用時現溶解。
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