NEK7--炎癥小體信號通路新發現的關鍵蛋白

炎癥小體（inflammasome）是能夠激活炎性caspase蛋白激酶的胞內蛋白復合體，它對于機體炎癥的發生與控制具有重要的調節作用。至今為止，已經有4類炎癥小體被發現：NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2。NLRP3發生突變能夠引發許多炎性疾病，包括冷吡啉相關周期性綜合征（CAPS）。目前已經知道鉀離子的外流對于NLRP3的外流具有重要的作用，但NLRP3是如何相應鉀離子外流的，目前仍不清楚。為了解釋這一問題，來自密歇根大學醫學院的Gabriel Nú?ez研究組致力于尋找能夠與NLRP3發生相互作用的其它蛋白。他們的zui近研究成果發表在zui近一期的《Nature》雜志上。

首先，他們通過液相色譜-質譜的手段鑒定出了一類叫做NIMA-related kinase 7（NEK7）的蛋白激酶，通過體外過表達Pull-Down以及免疫共沉淀的手段，作者也證明了在巨噬細胞受到LPS+ATP的刺激下能夠引發NEK7與NLRP3的相互結合。

進一步，為了尋找相類蛋白相互作用的位點，作者利用HEK293T細胞，并通過轉入外源性的野生NLRP3以及突變體NLRP3，zui終利用Pull-Down的方法檢測是否會發生相互作用。結果顯示：在HEK293T細胞中，野生NLRP3（即全長）能夠與NEK7發生相互作用，缺失了Pyrin結構域的NLRP3突變體也能夠發生相互作用，而缺失了LRR結構域的突變體則不能夠與NEK7發生相互作用；此外，單獨的LRR也無法與NEK7發生相互作用。這些結果說明NLRP3蛋白中的LRR以及NOD結構域對于兩者的相互作用具有關鍵作用。同理，作者向HEK293T細胞中轉入野生型與突變體NEK7，發現起到關鍵作用的是位于中部33-212的一段氨基酸序列。有意思的是，通過之前的研究，作者將NEK7具有酶活性的幾個位點氨基酸（均在33-212之間）進行了突變，發現這些突變并不會影響其與NLRP3的正常結合。這說明兩者的相互作用不依賴于NEK7的酶活。

由于純合的NEK7-/- 小鼠是致死的，因此作者不能夠通過常規的手段拿到NEK-/-小鼠。因此，作者利用輻照的方法將小鼠體內淋巴細胞殺死，并通過胎鼠肝細胞移植的技術構建了嵌合體。此時，根據移植進入的細胞的表型（野生，雜合，純合突變），便能夠從手體小鼠中達到野生型或者NEK7-/- BMDM。在此基礎上，作者對拿到的BMDM進行不同類型的刺激。結果顯示，ATP，Nigericin，Gramcidin（三者均能特異性激活NLRP3）三者的刺激能夠引發caspase1的切割以及IL-1b的釋放，NEK7-/-BMDM在以上刺激發生后caspase1的切割或者IL-1b的釋放則受到了抑制。與此不同，Poly（dA:dT）（特異性激活AIM2）以及salmonella（特異性激活NLRC4）的刺激則均能引發野生型BMDM以及突變體BMDM中caspase1的切割以及IL1b的釋放。除此之外，作者還利用shRNA的手段證明了上述現象（實驗過程基本一致）。以上結果說明Nek7的缺失能夠特異性阻斷NLRP3炎癥小體的激活。

接下來，作者研究了NEK7是否參與了炎癥小體蛋白復合體的聚集過程。首先，作者通過胞內染色免疫熒光的實驗方法比較了野生型BMDM以及突變體BMDM在刺激前后細胞內部ASC聚集的情況。結果顯示：在ATP，Nigericin刺激下，野生型BMDM內部出現明顯的ASC聚合體，而突變體BMDM中則沒有這一現象。與此不同，Poly（dA：dT）以及salmonella的刺激則均會引起ASC聚合體的產生。除此之外，作者通過交聯與生化分析手段驗證了上述ASC聚合體的形成區別。之后，作者還利用交聯生化檢測手段證明NLRP3以及NEK7本身的聚集也會受到NEK7與NLRP3的相互影響。此外，作者發現NLRP3與NEK7的相互作用還受到胞外鉀離子濃度的影響，即胞外鉀離子濃度高于50mM時，兩者的相互作用就會消失。

zui后，作者利用小鼠嵌合體進行體內LPS刺激，通過檢測IL-1b等細胞因子的釋放，證明了NEK7的缺失能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活以及IL-1b的釋放。

綜上，作者利用豐富的生化與體內實驗證明了NEK7是參與了NLRP3炎癥小體形成與激活的關鍵蛋白。

除上述文章外，諾貝爾獎得主，西南醫學中心免疫學教授Bruce Beutler在《nature immunology》雜志上也發表文章揭示了NEK7參與了NLRP3炎癥小體激活以及細胞有絲分裂過程，從而加深了該發現的可信度。