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組織化學和細胞化學染色方法(histochemical and cytochemical staining method)用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。
(一)固定
物理固定:血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。
化學固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定,顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。
(二)顯示方法
金屬沉淀法:如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反應產物zui終生成CoS或PbS有色沉淀,而顯示出酶活性。
Schiff反應:細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸(Feulgen反應)。
聯苯胺反應:過氧化酶分解H202。產生新生氧,后者再將無色聯苯胺氧化成聯苯胺藍,進而變成棕色化合物。
脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。
茚三酮反應:顯示蛋白質。
二、免疫細胞化學 immunocytochemistry
概念:根據免疫學原理,利用抗體同特定抗原專一結合,對抗原進行定位測定的技術。常用的標記物有熒光素和酶。
免疫熒光法(immunofluorescent technique):常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。
酶標免疫法(enzyme-labeled antibody method):常用的酶有辣根過氧化物酶,酶與底物發生反應后形成不透明的沉積物,從而顯示出抗原存在的部位。
三、顯微光譜分析技術
細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜,核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。
可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。
四、放射自顯影術
用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。
原理:將放射性同位素標記的化合物導入生物體內,經過一段時間后,制取切片,涂上鹵化銀乳膠,經放射性曝光,使乳膠感光。
一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA,用3H-UDR顯示RNA;用3H氨基酸研究蛋白質,用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。
14C半衰期為5730年,3H為12.5年。
五、分子雜交技術
具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當條件下,通過氫鍵結合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。
(一)原位雜交(in situ hybridization)。
用于檢測染色體上的特殊DNA序列。zui初是使用帶放射性的DNA探針,后來又發明了免疫探針法。
(二)Southern雜交
是體外分析特異DNA序列的方法,操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DN段,經凝膠電泳分離后,轉移到醋酸纖維薄膜上,再用探針雜交,通過放射自顯影,即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。
將RNA轉移到薄膜上,用探針雜交,則稱為Northern雜交。
六、PCR 技術
PCR即:polymerase chain reaction。
反應體系:①樣品DNA;②引物(primer),約15-20個核苷酸;③4種dNTP;④Tag DNA聚合酶,來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus,zui適作用溫度75~80℃,短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。
反應過程:①變性:約90-95℃;②復性:約60℃左右;③延伸:70-75℃;④重復 “變性——復性——延伸” 過程20-30次循環。
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