實時熒光定量PCR實驗體系的設計與優化

【資料簡介】

時熒光定量PCR以其、快速、方便，越來越多的應用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領域。但是定量PCR是對性要求很高的實驗，不僅要求在實驗前有比較完整的實驗設計方案，而且實驗的條件對實驗結果的影響也非常大。這些都是很多老師與學生非常關心的問題，下面分別從這兩個方面來對定量PCR實驗做一些闡述。 
定量pcr實驗步驟（以mRNA為例）： 
1.設計實驗方案：例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設計 
2.引物和探針的設計和合成 
3.抽提RNA，測定提取的RNA的濃度 
4.反轉錄PCR 
5.定量PCR 
6.數據分析 
在進行定量PCR實驗的過程中，PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素，因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率zui大值1，因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的性及重復性，影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面：1，擴增子的長度；2，擴增子的GC含量；3，擴增子、引物和探針的二級結構；4，PCR反應各組分的濃度；5，RNA或者cDNA的純度。 
進行定量PCR實驗時，必須設計好引物和探針，除了能獲得高的擴增效率外，對PCR擴增的特異性、消除基因組DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進行定量PCR的熒光曲線圖（反應條件和模板都相同）。

探針設計的基本原則：
1. 保守：探針要的保守，有時分型就僅僅依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。