慢性阻塞性肺疾病患者痰液白介素-8水平研究

【資料簡介】

【摘要】  探討慢性阻塞性肺疾病（COPD）痰中IL-8水平與氣流阻塞間關系。方法 對30例COPD患者、30例單純性慢性支氣管炎患者和30例健康志愿者誘導痰中細胞成分做染色分類，上清成分用酶聯(lián)免疫吸附試驗做白介素8（IL-8）水平測定。結果 痰細胞分類中，COPD組中性粒細胞、IL-8水平明顯高于單純性慢支組、健康組。COPD組中中性粒細胞、IL-8與1s用力呼氣容積（FEV1）占預計值百分比呈反比（P<0.01）。結論 慢性阻塞性肺疾病中性粒細胞、IL-8表達增加與吸煙者發(fā)展為氣流阻塞有關。

【關鍵詞】  阻塞性肺疾病 白介素8

    【Abstract】  Objective  To determine the relationship between the level of interleukin-8 （IL-8） in sputum and airway obstruction in patients with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）.Methods  Cells in induced sputum from 30 cases of COPD, 30 cases of chronic bronchitis and 30 healthy volunteers were stained and analyzed micropically. IL-8 in fluid-phase was measured with enzyme linked immunosorbent assay.Results  The percentage of neutrophils and the level of IL-8 in sputum from COPD patients were significantly higher than those from chronic bronchitis patient and normal subjects. FEV1% correlated negatively with IL-8 （r=-0.85,P<0.01） and the percentage of neutrophils （r=-0.79,P<0.01） in COPD.Conclusion  The level of IL-8 and neutrophils represents a marker for the smokers who get COPD.

    【Key words】  chronic obstructive pulmonary disease; interleukin-8

    慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種慢性氣道炎癥性疾病，中性粒細胞（NC）是主要的炎癥細胞［1］。痰中中性粒細胞數(shù)與患者的氣道阻塞、痰量高度相關，中性粒細胞釋放的蛋白酶及氧化物是引起炎癥損傷和肺氣腫的主要原因。

    吸煙是導致COPD的重要病因，約90%的COPD患者是吸煙者，然而僅20%的吸煙者發(fā)展為COPD［2］。在臨床上?？梢姷酵瑯游鼰熓返娜巳?，有的發(fā)展為氣流阻塞（COPD），有的僅有咳嗽咳痰癥狀而無氣流阻塞（慢性支氣管炎），筆者猜想前者肺內IL-8表達增強，從而氣道內中性粒細胞聚集增多，對氣道壁破壞增加造成氣流阻塞。

　　1  對象與方法

    1．1  病例選擇  COPD組：COPD穩(wěn)定期［3］患者30例，男16例，女14例，年齡52～65歲。1s用力呼氣容積（FEV1）占預計值百分比為48.8%+9.6%。平均吸煙指數(shù)為400+25。單純慢支組30例，其中男14例，女16例，年齡31～60歲。1s用力呼氣容積（FEV1）占預計值百分比為94.9%+3.5%。平均吸煙指數(shù)為350+25。健康組：30例，其中男15例，女15例，年齡29～62歲，F(xiàn)EV1%預計值102.5%+8.1%。均為非吸煙者或戒煙20年以上。以上3組受試者8周內無呼吸道感染或氣道疾病加重，12周內未服用糖皮質激素類藥物。

    1．2  實驗方法  （1）痰標本收集和處理：應用誘導痰方法，霧化吸入3.5%的高滲鹽水10～20min，鼓勵病人漱口，用力咳出深部痰，肉眼選取0.5～1ml無唾液污染帶有白色痰栓的痰液，加入4倍量0.1%DTT，37℃孵育20min，溶解痰液，再加入上等量磷酸鹽緩沖液（0.01M、pH7.4 PBS）充分洗滌細胞，經(jīng)48μm濾網(wǎng)除去黏液及細胞碎渣，2000r/min離心10min，細胞沉淀用PBS調至1×106后用細胞離心甩片機制備細胞涂片，2張做細胞分類用，另2張做免疫組化用?？紤]到DTT可以破壞IL-8的二硫鍵，另選取1ml無唾液污染痰液，加入3ml的PBS后混勻，16000r/min離心20min，留取上清-70℃保存，待測IL-8用。（2）細胞計數(shù)及分類：用適量PBS懸浮上述細胞沉淀，取1小滴置血球計板上，計數(shù)除上皮細胞外的有核細胞，得出每升的痰細胞數(shù)。若上皮細胞>50%，表明標本不合格。取兩張上述制備好的細胞涂片做瑞-姬染色，油鏡下數(shù)200個細胞，得出各種細胞所占百分率。（3）IL-8測定：采用酶聯(lián)免疫法，IL-8試劑盒由第四軍醫(yī)大學免疫教研室提供，操作按說明進行。

    1．3  統(tǒng)計學處理  均值比較用t檢驗，率比較用率檢驗，相關性用直線相關分析。

　　2  結果

    2.1  3組痰液中細胞計數(shù)及分類  經(jīng)瑞-姬染色油鏡下做細胞分類計數(shù)。COPD組細胞總數(shù)為3.0×106/ml，與健康組0.32×106/ml相比差異有顯著性（P<0.01），與慢支組2.5×106/ml相比差異無顯著性（P>0.05）。COPD組中性粒細胞分類占0.696，與健康組0.222、慢支組0.529相比差異均有顯著性（P<0.01）。見表1。表1  3組痰液中細胞計數(shù)及分類注：與健康組相比，*P<0.01,△P>0.05

    2.2  IL-8水平比較  COPD組IL-8水平為0.720pg/ml，與慢支組（0.559pg/ml,P<0.01）、健康組（0.161pg/ml,P<0.01）比較差異有顯著性。

2.3  COPD組中各檢測指標間相關分析  COPD組中中性粒細胞、IL-8與1s用力呼氣容積（FEV1）占預計值百分比成反比（r=-0,79,P<0.01;r=-0.85,P<0.01），且IL-8與中性粒細胞呈正相關（r=0.68,P<0.01）。

　　3  討論

    IL-8 是一重要炎癥介質，屬于趨化性細胞因子超家族中的α亞群，人IL-8基因定位于染色體4q12～21，堿基數(shù)為5.2KB，IL-8為8.0KD 的多肽，前體是含22個氨基酸先導序列的99多肽，經(jīng)多次氮端切除后產生77aa、72aa、69aa三種形式。IL-8的兩種受體形式A和B已從中性粒細胞和HL-60細胞cDNA文庫證實，NC表面約有20,000個高親和力型受體，越成熟表達越多［4］。

    目前認為NC肺內募集的主要機制如下：首先是選擇素介導中性粒細胞與靜脈內皮細胞（EC）發(fā)生初次接觸，EC表面E-Select、P-Select與中性粒細胞的L-Select相結合，但作用較弱，中性粒細胞在流動中翻滾于EC上，之后在EC表面結合的IL-8作用下，中性粒細胞的B2-整合素（CD11/CD18）表達上調，與EC的細胞間粘附分子（ICAM-1,2）結合使中性粒細胞粘附于EC上,進而附壁游出釋放多種蛋白酶如：中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、組織蛋白酶、金屬蛋白酶。它們可刺激氣道黏液分泌過多，造成慢性支氣管炎長期咳痰癥狀，還可導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，破壞肺泡壁形成肺氣腫。

    本實驗結果表明COPD組IL-8水平、中性粒細胞計數(shù)明顯高于單純慢支、健康組，且IL-8、中性粒細胞數(shù)與FEV1%呈明顯負相關。

    目前對穩(wěn)定期COPD病人治療仍以戒煙、控制感染、祛痰止咳、解痙平喘為主。但這些治療能否降低IL-8水平尚未見報道。進一步尋求新的IL-8合成抑制劑，IL-8受體阻斷劑，可能將成為治療COPD的新途徑［5］。誘導痰方法無創(chuàng)傷，安全，不受病情限制，重復性好，痰液炎性標志物IL-8、中性粒細胞數(shù)與肺功能（FEV1%）相關，可作為檢測氣道炎癥嚴重程度及療效評估的指標［6］。

【參考文獻】
  1 Stanescu D, Fournier M,Lebargy F, et al. Airway obstruction, chronic expectoration and rapid decline of FEV1 in smokers are associated with increased levels of sputum neutrophils. Thorax, 1996,51:267-271.

2 Repine JE, Bast A, Lankhorst I. Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med, 1997,156:341-357.

3 慢性阻塞性肺疾?。–OPD）診治規(guī)范（草案）. 中華結核和呼吸雜志, 1997,20:199-203.

4 Soejima K，F(xiàn)ujishima S，Nakamura H，et al.Downmodulation of IL-8 receptors, type A and type B, on human lung neutrophils in vivo. Am J Physiol, 1997, 273:618-625.

5 Barnes P.New therapies for chronic obstructive pulmonary disease.Thorax, 1998,53:137-147.

6 Yamamoto C, Yoneda T，Yoshikawa M，et al. Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8. Chest, 1997，112（2）：505-510.