人 干擾素 （ IFN- γ ） 試劑盒說明書

【資料簡介】

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人 γ干擾素 (IFN- γ ) 酶聯(lián)免疫 分析（ ELISA ）
試劑 盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關
液體樣本 中 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 的 含量。
實驗原理 ：
本試劑盒應用 雙抗體 夾心法測定 標本 中 人 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 水平。用純化的 人 γ 干擾素
( IFN- γ ) 抗體 包被微孔板，制成固相 抗 體，往包被 單抗 的微孔中依次加入 γ 干擾素 ( IFN- γ ) ，
再與 HRP 標記的 IFN- γ 抗體結(jié)合，形成抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物 ，經(jīng)過*洗滌后 加 底
物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。
顏色的深淺和樣品中的 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 呈正相關 。 用酶標儀 在 450 n m 波長下測定吸光度 （ O D
值 ） ， 通過標準曲線 計算樣品 中 人 γ 干擾素 ( IFN- γ ) 濃度 。
試劑盒組成 ：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（ 48 ） 2 片（ 96 ）
密封袋 1 個 1 個
酶標包被板 1 × 48 1 × 96 2-8 ℃ 保存
標準品： 1350pg/ml 0.5ml × 1 瓶 0.5ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
標準品稀釋液 1.5ml × 1 瓶 1.5ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
酶標試劑 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
樣品稀釋液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
顯色劑 A 液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
顯色劑 B 液 3 ml × 1 瓶 6 ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
終止液 3ml × 1 瓶 6ml × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
濃縮洗滌液 （ 20ml × 20 倍） × 1 瓶 （ 20ml × 30 倍） × 1 瓶 2-8 ℃ 保存
樣本處理及要求 ：
1. 血清 ： 室溫血液自然凝固 10-20 分鐘 ， 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。 仔細收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離 心
20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次
離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清 ： 檢測分泌性的成份時 ， 用無菌管收集 。 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn) /
分 ） 。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞
濃度達到 100 萬 /ml 左右 。 通過反復凍融 ， 以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份 。 離心 20 分
鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。2
5. 組織標本 ： 切割標本后 ， 稱取重量 。 加入一定量的 PBS ， PH7.4 。 用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br>用。標本融化后仍然保持 2-8 ℃ 的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ） ，用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分 ） 。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗，可 將標本放于 -20 ℃ 保存，但 應 避免反復凍融 .
7. 不能檢測含 NaN3 的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標
準品 100 μ l ， 然后在* 、 第二孔中加標準品稀釋液 50 μ l ， 混勻 ； 然后從*孔 、 第二
孔中各取 100 μ l 分別加到第三孔和第四孔 ， 再在第三 、 第四孔分別加標準品稀釋液 50 μ l ，
混勻 ； 然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l 棄掉 ， 再各取 50 μ l 分別加到第五 、 第六孔
中 ， 再在第五 、 第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul ， 混勻 ； 混勻后從第五 、 第六孔中各
取 50 μ l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50 μ l ，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50 μ l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液 50 μ l ，混勻后從第九第十孔中各取 50 μ l 棄掉 。 （稀釋后各孔加樣量都為 50 μ l ，
濃度分別為 900 pg/ml ， 600 pg/ml ， 300 pg/ml ， 150 pg/ml ， 75 pg/ml ） 。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同 ） 、 待測樣
品孔 。 在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μ l ， 然后再加待測樣品 10 μ l （ 樣
品zui終稀釋度為 5 倍 ） 。 加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁， 輕輕 晃動 混
勻 。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃ 溫育 3 0 分鐘 。
4. 配液 ： 將 30 （ 48T 的 20 倍 ） 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍 ） 倍稀釋后備用 。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體， 甩干 ，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50 μ l ，空白孔除外 。
7. 溫育：操作同 3 。
8. 洗滌：操作同 5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μ l ，再加入顯色劑 B50 μ l ，輕輕震蕩混勻， 37 ℃ 避光顯 色
15 分鐘 .
10. 終止：每孔加終止 液 50 μ l ，終止反應 （此時藍色立轉(zhuǎn)黃色 ） 。
11. 測定 ： 以空白空調(diào)零 ， 4 50 nm 波長依序測量各孔的 吸光 度 （ OD 值 ） 。 測定應在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
1 ． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2 ． 濃洗滌液 可能 會有 結(jié)晶 析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶 ，洗滌時不影響結(jié)果。
3 ． 各步加樣均應使用加樣器 ， 并經(jīng)常校對其準確性 ， 以避免試驗誤差 。 一次加樣時間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。
4 ． 請每次測定的同時做標準曲線 ， 做復孔 。 如標本中待測物質(zhì)含量過高 （ 樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值 ） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定 ， 計
算時請zui后 乘以 總稀釋倍數(shù)（ × n × 5 ） 。
5 ． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ． 底物請避光保存。3
7 ． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準 .
8 ． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9 ． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算 ：
以標準物的濃度為橫坐標， OD 值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以 稀釋
倍數(shù) ；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以 稀釋
倍數(shù) ，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2. 批內(nèi)與批間應分別小于 9% 和 15%
檢測范圍：
30 pg/ml -1000 pg/ml
保存條件及有效期：
1. 試劑盒保存： 2-8 ℃ 。
2 ．有效期： 6 個月