組織氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑盒產品說明書

【資料簡介】

主要用途

組織氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑是一種旨在通過捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧化，進而與偶氮染料反應，產生黃色產物，由分光光度儀比色分析 ，來定量檢測組織細胞內羥自由基活性氧族的生成和增加的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種組織（動物、人體等）裂解懸液的羥自由基檢測，以及羥自由基激發劑和抗氧化清除劑（scanvenger）等的檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應性和毒性，同時半衰期短（10－9至10－10秒）。其產生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過氧化物和次氯酸反應、過氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產生黃色產物偶氮亞砜（diazosulfone），通過分光光度儀（325nm波長），檢測未反應棕色成分，以測定羥自由基的含量。據此證明組織細胞內活性氧族的存在。其反應系統為：

            DMSO   +    OH      → MSA  +  CH3

                 MSA  +diazonium dye   →  diazosulfone +   H+

產品內容

清理液（Reagent A）    120毫升

標記液（Reagent B）    300微升

酸性液（Reagent C）    1毫升

染色液（Reagent D）    5瓶

凈化液（Reagent E）                                    30毫升

終止液（Reagent F）    50毫升

萃取液（Reagent G）                                     30毫升

穩定液（Reagent H）         2.5毫升

標準液（Reagent I）     2毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）和標準液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和凈化液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；凈化液（Reagent E）、萃取液（Reagent F）容易揮發，注意密閉；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標準液配制的容器

2.2毫升離心管：用于樣品操作的容器

5毫升玻璃管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織細胞裂解

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

1毫升1厘米光徑石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入1毫升清理液（Reagent A）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g
• 小心移取3毫升上清液到新的預冷的1.5毫升錐形離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入450微升清理液（Reagent A）到2至5號管
• 移取900微升標準液（Reagent I）到1號管
• 小心移取450微升1號管的標準液（Reagent I）到2號管，混勻
• 小心移取450微升2號管稀釋的標準液（Reagent I）到3號管，混勻
• 小心移取450微升3號管稀釋的標準液（Reagent I）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

管號	清理液（Reagent A）	標準液（Reagent G）	測定體系標準MSA濃度
1	－	900微升	100微摩爾/升
2	450微升	450微升1號管	50微摩爾/升
3	450微升	450微升2號管	25微摩爾/升
4	450微升	450微升3號管	12.5微摩爾/升
5	450微升	0	0

• 標準曲線測定

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出5毫升清理液（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，加入5毫升凈化液Reagent E），混勻后，移取5毫升上層液相到新的10毫升瓶里(注意使用PE或玻璃瓶），標記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用6次）。然后進行下列操作

標記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用6次）。 放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 移取400微升上述配制的標準液（Reagent I）到2毫升離心管
• 加入40微升酸性液（Reagent C）
• 加入800微升染色工作液，手動混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入1.2微升終止液（ReagentF），手動混勻
• 渦旋震蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到新的2.2毫升離心管
• 加入1毫升萃取液（Reagent G），手動混勻
• 渦旋振蕩1秒
• 靜置分層
• 小心移取1毫升上層液相到新的比色皿
• 加入100毫升穩定液（Reagent H）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進分光光度儀（420nm波長）檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至15四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準MSA濃度（微摩爾/升）