還原糖和總糖的測定實驗

【資料簡介】

實驗方法原理    各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖*水解成有還原性的單糖。在堿性條件下，還原糖將3,5-二硝基水楊酸還原為3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色物質），還原糖則被氧化成糖酸及其它產物，在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質深淺的程度呈一定的比例關系，在540nm波長下測定棕紅色物質的消光值，查對標準曲線并計算，便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。多糖水解時，在單糖殘基上加了一分子水，因而在計算中須扣除已加入的水量，測定所得的總糖量乘以0.9 即為實際的總糖量。
實驗步驟    
一、實驗材料、儀器和試劑

1、實驗材料：面粉。

2、儀器： (1) 25ml *或刻度試管×11；(2) 大離心管或玻璃漏斗×2；(3) 燒杯：100ml×1；(4)三角瓶：100ml×1；(5) 容量瓶：100ml×3；(6) 刻度吸管：1ml×11、2ml×4、10ml×1；(7) 恒溫水浴；(8)沸水浴；(9) 離心機(過濾法不用此設備)；(10)電子天平；(11)分光光度計；

3、試劑：

(1) 1mg/ml葡萄糖標準液：準確稱取 100 mg分析純葡萄糖(預先在 80 ℃烘至衡重)，置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉移至100ml的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存備用。

(2) 3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3g 3,5-二硝基水楊酸和262ml 2NNaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲鈉的熱水溶液中，再加5g結晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。

(3) 碘-*溶液：稱取5g碘和10g*，溶于100ml 蒸餾水中。

(4) *指示劑：稱取0.1g*，溶于250ml 70%乙醇中。

(5) 6NHCl

(6) 6NNaOH

二、操作步驟

1、制作葡萄糖標準曲線：

取7支具有25ml刻度的*或試管，編號，按下表所示的量，加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標準液和3,5-二硝基水楊酸試劑。

將各管搖勻，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至25ml刻度處，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻（如用大試管，則向每管加入21.5ml蒸餾水，混勻）。在540nm波長下，用0號管調零，分別讀取1-6號管的消光值。以消光值為縱坐標，葡萄糖毫克數為橫坐標，繪制標準曲線。

2、樣品中還原糖和總糖的測定：

（1）樣品中還原糖的提取：

準確稱取2g食用面粉，放在100ml的燒杯中，先以少量的蒸餾水調成糊狀，然后加50ml蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20分鐘，使還原糖浸出。離心或過濾，用20ml蒸餾水洗殘渣，再離心或過濾，將兩次離心的上清液或濾液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。

(2)樣品中非還原糖的水解和提取：

準確稱取1 g食用面粉，放在100ml 的三角瓶中，加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸餾水，置于沸水浴中加熱水解30分鐘。取1~2 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-*溶液，檢查水解是否*。如已水解*，則不顯藍色。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入一滴*指示劑，以6NNaOH中和至微紅，過濾，再用少量蒸餾水沖洗三角瓶及濾紙，將濾液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻。吸取10ml定容過的水解液，移至另一100ml的容量瓶中，定容，混勻，作為總糖待測液。

(3)顯色和比色：

取5支25ml刻度的血糖或刻度試管，編號，按下表所示的量，加入待測液和試劑。

收起 
注意事項    

其他    
1、用*比大試管方便。

2、離心比過濾易得清液。

3、標準曲線制作與樣品含糖量測定應同時進行，一起顯色和比色