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士鋒蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離和純化
資料類型 | png文件 | 資料大小 | 51812 |
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關(guān) 鍵 詞 | 士鋒蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離和純化,士鋒蛋白質(zhì)的表達(dá)、 |
- 【資料簡介】
目的要求
(1)了解克隆基因表達(dá)的方法和意義。
(2)了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。
實(shí)驗(yàn)原理
克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有重要的意義。通過表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理,同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用zui廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng),其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的80%。本實(shí)驗(yàn)中,攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中,在 37℃,IPTG誘導(dǎo)下,超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)殘基的重組酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價(jià)偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質(zhì)加以提純,實(shí)為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。
試劑和器材
一、試劑
[1] LB液體培養(yǎng)基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸餾水配至1000mL.
[2] 氨芐:100mg/mL
[3] 上樣
緩沖液:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0
[4] Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
[5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0
[6] IPTG
二、器材
搖床,離心機(jī),層析柱(1′10 cm)
操作方法
一、酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)
1. 接種含有重組酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100ug/mL 氨芐),37℃震蕩培養(yǎng)過夜。
2. 轉(zhuǎn)接1mL過夜培養(yǎng)物于100mL(含100ug/mL 氨芐)LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
3. 加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l, 37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h.
4. 12,000rpm 離心10 min, 棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
二、酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
1. NTA層析柱的準(zhǔn)備:在層析柱中加入1mL NTA介質(zhì),并分別用8mL 去離子水,8mL上樣緩沖液洗滌。
2. 重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入5mL上樣緩沖液, 用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min, 4℃ 12000rpm 離心 30 min, 將上清吸至一個(gè)干凈的容器中,并棄沉淀。取10ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
3. 上清樣品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
4. 洗脫雜蛋白:用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01.分步收集洗脫液,約3-4h,取10ul洗脫開始時(shí)的樣品用于SDS-PAGE 分析。
5. 洗脫目標(biāo)蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 級(jí)分,分別取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
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