*酰化探針的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

【資料簡(jiǎn)介】

比色法
實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    磷酸酶緩沖液封阻液牛血清蛋白TENBT
儀器、耗材    離心機(jī)分光光度計(jì)搖床
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  用DNA稀釋緩沖液，稀釋*酰化標(biāo)準(zhǔn)DNA，濃度為0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同樣稀釋液處理待測(cè)DNA。

2.  對(duì)干硝酸纖維素濾膜：每個(gè)稀釋度取1 μl 點(diǎn)膜，在80℃供干約1 h接步驟4。
 
3.  對(duì)于足龍膜：每個(gè)稀釋度取1 μl 點(diǎn)膜，晾干后用紫外照射法將DNA交聯(lián)至膜上。接步驟4或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
 
4.  用少量體枳AP7.5液沆膜1 min，在密封袋中（剪成合適大小），用10 ml 封阻液，37℃封閉1 h 注意排出氣泡。

5.  稀釋10 μl 親和素-AP交聯(lián)物至10 ml AP7.5。剪去封閉袋一角擠出封閉液，用親和素-AP交聯(lián)物代替，重新封口，在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)室溫?fù)e蕩10 min。

6.  從袋中取出濾膜移到一個(gè)淺盤中，用200 ml AP7.5冼2次，每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次，10 min，輕微搖蕩。

7.  加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中，混勻。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP，混勻。

8.  在淺盤中避光溫育溶液，不時(shí)觀察直至發(fā)色達(dá)到滿意程度為止。
 
9.  加TE pH8.0以終止反應(yīng)，比較測(cè)定DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)DNA的顏色強(qiáng)度以確定*酰化dNTP的摻入效率。如果該探計(jì)至少有一半標(biāo)準(zhǔn)品的強(qiáng)度，它可作為探針用于原位雜交。
化學(xué)發(fā)光法
實(shí)驗(yàn)材料    DNA
試劑、試劑盒    *磷酸酶
儀器、耗材    紫外燈離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  用夾子固定已轉(zhuǎn)印的尼龍膜的邊角于一小片干的吸水紙上，樣品面朝上，放進(jìn)溫箱內(nèi)12~80℃放15~30 min 或溫室晾干過。
 
2.  將帶核酸的面朝上暴露于紫外燈下，用zui適的時(shí)間交聯(lián)。

3.  用*探針與膜雜交，用適當(dāng)強(qiáng)度的洗液洗滌。
 
4.  雜交后、將膜置于雜交袋中。
 
5.  封口，在一個(gè)角留有一小孔便于加入和排出液體。

6.  加入1體積的封阻液、室溫作1 min 輕微搖動(dòng)、倒干溶液。
 
7.  加入1 mg/ml 鏈親和素至1體積的封阻液至終濃度為1 μg/ml，在雜交袋中室溫溫育4 min，輕微搖動(dòng)，倒干溶液。

8.  加入10體積詵液 I，室溫洗膜4 min 輕微搖動(dòng)，倒干溶液，重復(fù)1次。

9.  加入*酰化堿性磷酸酶至1體積的封阻液，室溫作用4 min 輕微搖動(dòng)、倒干溶液。

10.  用10體積洗液 I 洗膜2次，同步驟8。
 
11.  用0.5體積底物稀釋液稀釋化學(xué)發(fā)光底物，在雜交袋中室溫作用4 min 輕微搖動(dòng)，打開雜交袋，盡可能倒干溶液。

12.  壓平雜交袋上的折皺，重新封口，結(jié)合核酸的一面向上，用一張X光片壓好，在暗盒內(nèi)曝光10~20 min。