磷酸鈣介導的真核細胞轉染實驗

【資料簡介】

實驗材料    真核細胞
試劑、試劑盒    CaCl2HEPES緩沖化銫PBS
儀器、耗材    培養箱錐形管離心管
實驗步驟    
1.  在轉染前一天將細胞分入10 cm 組織培養平板中。當被轉染的細胞是貼壁細胞，倍增時間為18~24 h時，一般按1：15從長滿的培養皿中分細胞效果較好，轉染的當天，細胞應在培養皿中很好地分散分布。在加入沉淀前2~4 h，用9 ml *培養液培養細胞。
 
2.  將要轉染的DNA用乙醇沉淀，空氣中晾干沉淀。將DNA沉淀重懸于450 μl 無菌水中，加50 μl 2.5 mol/l CaCl2。
 
3.  加500 μl 2×HeBS于一無菌的15 ml 錐形管中，將機械式移液器安上1 ml 吸頭， 一邊吹打2XHeBS，一邊用巴斯德吸管逐滴加入DNA/CaCl2溶液，隨即在漩渦混合器上振蕩5 s，將其在室溫下靜置20 min 以形成沉淀。

4.  將沉淀均勻加入10 cm 平板的細胞中，輕輕晃動。
 
5.  在標準生長條件下培養細胞4~16 h，除去培養液，用5 ml 1×PBS洗細胞2次，加 10 ml *培養液培養細胞。

6.  對于短暫分析實驗，可在既定的時刻收集細胞。對于穩定轉化，讓細胞生長兩個倍增時間后分入培養皿中進行選擇培養。
實驗材料    真核細胞
試劑、試劑盒    *培養液TEBES
儀器、耗材    培養箱平板
實驗步驟    
1.  轉染前一天接種呈指數生長的細胞，密度為5×105/10 cm  平板。加10 ml *培養液，在開始轉染時細胞數應＜106/平板，以留足夠供細胞擴增至少2倍的表面積。

2.  用TE緩沖液稀釋質粒DNA至1 μg/μl ，4 ℃保存。
 
3.  將zui適量的質粒DNA與500 μl 0.25 mol/l CaCl2混合，加入500 μl 2×BBS中，混勻，室溫下溫育10~20 min。

4.  將磷酸鈣-DNA溶液逐滴加入培養皿的細胞中，同時晃動培養皿，在35℃ 3%CO2培養箱中溫育15~24min。
 
5.  用5 ml PBS洗細胞兩次，加入10 ml *培養液。對于穩定轉化，在35~37℃ 5%CO2培養箱中培養。對于短暫表達，培養細胞48~72 h。
 
6.  在開始選擇穩定的轉化細抱前按1：10至1：30分傳細胞。于35~37℃培養箱中培養。
 
7.  將培養液換成選擇培養液，或在適當的選擇條件下培養細胞進行選擇穩定的轉化子。