蛋白質(zhì)測(cè)定方法之雙縮脲法（Biuret法）

【資料簡(jiǎn)介】

一）實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲（NH₃CONHCONH₃）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO₄形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分的蛋白質(zhì)測(cè)定。

（二）試劑與器材

1.試劑：

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H₂O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO₄?5H₂O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC₄H₄O₆?4H₂O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

2.器材：

可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20~25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、樣品的測(cè)定：取2~3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。

三、Folin—酚試劑法（Lowry法）

（一）實(shí)驗(yàn)原理

這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是zui靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的和苯殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法zui早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。

進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加F olin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于和的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的zui低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

（二）試劑與器材

1.試劑

（1）試劑甲：

（A）10克Na₂CO₃，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC₄H₄O6?4H₂O）。溶解于500毫升蒸餾水中。

（B）0.5克硫酸銅（CuSO₄?5H₂O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

（2）試劑乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na₂WO4?2H₂O）,25克鉬酸鈉（Na₂MoO4?2H₂O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰（Li2SO₄），50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使zui終的酸濃度為1N左右。

（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:

稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

2.器材

（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支

（三）操作方法

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的*支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待zui后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。

進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。zui下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。

2.樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。

根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的和苯，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。