酵母質粒小量抽提試劑盒說明書

【資料簡介】

使用說明：
1. 取培養過夜的酵母1.5毫升，5000g離心1分鐘收集酵母沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3毫升培養過夜的酵母。
再在離心機快速離心一下(5000g離心1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液體。
通常酵母宜30°C培養過夜(16-24小時左右)。建議5000g(~5000-6000rpm)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時
間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于后續加入溶液I后充分重懸沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫
升酵母液并重復上述的離心操作，然后直接倒掉上清，再在離心機快速離心一下(5000g 1-2秒)，用移液器小心吸盡殘余液
體。殘余液體必須吸盡，否則可能會干擾后續的酶解反應。如果酵母密度明顯偏低，可考慮使用更多酵母液，再重復上
述操作1-2次。所用酵母量一般不宜超過5ml。過量的酵母會導致后續的酶解和堿裂解不充分。
2. 每管加入100微升酶解緩沖液，重懸酵母沉淀。確保沉淀*散開，無可見酵母團塊。
可以通過劇烈Vortex來重懸沉淀。
3. 加入20微升配制好的Lyticase溶液，充分混勻，30℃水平搖床200-250rpm孵育0.5-1小時。。
注意：根據酵母菌株和酵母細胞數量的不同，酶解的孵育時間可進行適當調整。當酵母用量較大時，酶解的孵育時間需
延長。孵育時間延長到2-3小時通常不會對質粒抽提帶來負面影響。
4. 1500g (~3000-4000rpm)離心10鐘，棄上清，收集沉淀。
直接倒掉上清，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。也可在直接倒掉上清后再在離心機內甩一下，用移液
器吸盡殘留液體。不同離心機因離心半價的不同g和rpm的換算值有所不同。
5. 每管加入250微升溶液I，重懸酵母沉淀。確保沉淀*散開，無可見酵母團塊。
確認溶液I中已經添加了RNase A。由于此時酵母細胞壁已經去除，重懸操作要溫和，不宜劇烈振蕩，否則會容易導致基
因組DNA的污染。但同時必須保證沉淀充分散開，即必須確保酵母細胞充分分散到溶液中。
6. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致zui終所得質粒被基因組DNA污染。遇到有少量團塊或
絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。
7. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。
切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致zui終所得質粒的質量下降。
8. zui高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會產生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。
9. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。zui高速離心30-60秒，倒棄收集管內液體。
質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。
10. 在質粒純化柱內加入750微升溶液IV，zui高速離心30-60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。
11. zui高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇*揮發。
注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。
12. 將質粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內柱面上，放置1分鐘。
溶液V 需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V 沾在管壁上，一定要震動管子，使液體滑
落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 級純水替代溶液V，但是水的pH 應不小于6.5。溶液V 加入后
放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。
13. zui高速離心1分鐘，所得液體即為高純度酵母質粒。