簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法具體操作步驟

【資料簡(jiǎn)介】

簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法 本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所 獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和Ig結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重 大損失，是目前zui常用的方法。

1. 原理：經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以 避免酶分子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝 基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成 斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

2. 標(biāo)記步驟: (1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)一夜。

(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小 時(shí)。

(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時(shí)。

(6) 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過(guò)夜。 其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。

3. 結(jié)果判定： 除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62