蛋白純化的三種新工具

【資料簡介】

Biotechniques雜志盤點了近期出現的三種新蛋白標簽系統，以便為研究者們提供更大的選擇空間。這三種蛋白標簽系統分別利用了高親和力單抗、無機礦物基質、以及能夠剪切標簽的金屬離子。 

 

蛋白親和標簽是蛋白質組研究中的一個關鍵性工具，迄今為止人們已經開發出了許多久經考驗的蛋白標簽系統，例如六聚*、HA、Myc和FLAG等等。盡管這些標簽系統各具特色，但它們也分別存在著一些缺陷，還不能*研究者們的需要。
為此，Biotechniques雜志盤點了近期出現的三種新蛋白標簽系統，以便為研究者們提供更大的選擇空間。這三種蛋白標簽系統分別利用了高親和力單抗、無機礦物基質、以及能夠剪切標簽的金屬離子。（*閱讀：2013年蛋白質分析文章精選）
日本研究者Yukinari Kato在開發膠質母細胞瘤的治療性抗體時，無意中發現了一個可用作親和標簽的肽段。Podoplanin蛋白是一個在惡性癌細胞中高度表達的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠單克隆抗體NZ-1可以靶向該蛋白中一個14個殘基的肽段。Kato在ELISA實驗中注意到，NZ-1與podoplanin蛋白的親和力特別高，于是他與大阪大學的Junichi Takagi合作，希望將其開發成為一個蛋白標簽系統。
研究人員將與NZ-1結合的podoplanin肽段稱為PA標簽，并將其與現有的其他標簽系統進行比較（FLAG、HA和Myc）。他們發現，NZ-1和PA標簽之間的親和力更高，解離更慢。Takagi嘗試用這一系統來分離，哺乳動物細胞分泌到培養基中的重組蛋白。這些重組蛋白的初始濃度較低，比較難于分離和純化。
研究人員發現，細胞培養液上清中的PA標記蛋白，能夠有效結合NZ-1-瓊脂糖。此外，0.1 mg/ml的PA標簽溶液可以將融合蛋白競爭性的洗脫下來。隨后，Takagi又通過NZ-1-瓊脂糖層析純化了15種不同分子量的分泌蛋白，這些蛋白的純度都超過了95%。
據介紹，這一系統的關鍵優勢在于，可以在無損抗體柱的情況下很方便的進行再生。研究顯示，高鹽緩沖液可以*去除結合在抗體上的PA標簽，進行60次結合-洗脫-再生的循環，也不會對柱子的結合能力產生任何影響。生物通 www.ebiotrade.com 
目前，上述系統還不能兼容人類細胞。“我們正在晶體結構的引導下，設計不識別人類podoplanin的改進版NZ-1，只保留它與標簽肽段的高親和力，”Takagi說。他現在正努力將這一標簽系統應用到蛋白質組分析中去，希望能夠用其替代FLAG標簽。
磷灰石基質
人們常常用固化的抗體和金屬離子來純化重組蛋白，不過這些方案并不，存在著金屬離子析出、穩定性低、和成本高等問題。為此。Jacobs大學的Marcelo Fernandez-Lahore用無機礦物氟磷灰石，開發了一個新的親和標簽純化系統。
以磷酸鈣為基礎的磷灰石（例如羥磷灰石和氟磷灰石），幾十年來一直被用作生物分子的吸附劑，其優勢在于這種物質既沒有抗原性也沒有細胞毒性。然而，人們一直未能將它們用于層析法蛋白純化。這是因為此前的磷灰石基質“顆粒形狀不規則，而且在某些條件下很容易溶解，”Fernandez-Lahore說。而近期商業化的CFT珠（macroporous ceramic fluorapatite）解決了上述問題。
Fernandez-Lahore實驗室在這種材料的基礎上，開始尋找與氟磷灰石高度親和的標簽肽段。研究人員通過噬菌體展示篩選，發現肽段KPRSVSG與CFT的結合能力很強，于是他們決定將這個CFT結合肽段（CBP）開發成為蛋白純化的親和標簽。

研究團隊在CFT柱層析實驗中發現，由賴氨酸組成的肽段滯留時間更長。于是他們又添加了六個賴氨酸，對原本的CBP進行優化。研究顯示，用這種標簽純化融合蛋白，純度超過了90%。生物通 www.ebiotrade.com 
研究人員指出，與使用固化抗體或金屬離子的傳統系統相比，CBP/CFT珠組成的系統可以彌補一些缺陷，是蛋白親和純化的另一條寶貴途徑。未來，研究人員將會用這一系統，對不同大小、不同特性、不同表達系統（例如哺乳動物或酵母表達系統）的蛋白進行測試。Fernandez-Lahore還指出，這一標簽可以“實現可逆的固化，有望應用于醫學診斷或細胞分析。”
二合一系統？
盡管許多蛋白與親和標簽融合后也能夠正常工作，但不少實驗還是要求去除這些標簽。人們往往將剪切位點設計在蛋白標簽旁邊，以便用蛋白酶消化時能夠將其切下來。
為了進一步簡化這一過程，哥本哈根大學的Niels Erik Møllegaard提出了一個有趣的新標簽系統。在該系統中，一個分子可以同時實現親和結合和蛋白標簽的剪切，這個分子就是二價鈾酰離子（UO22+）。
Møllegaard及其團隊研究DNA和RNA的鈾酰（uranyl）剪切已經幾十年了。“這種物質的剪切能力在于它能與磷酸基團高度親和，” Mollegaard說。“我們嘗試用它進行蛋白剪切也有好幾年了。”
四年前研究團隊發現，鈾酰可以在蛋白中對磷酸化的*進行光切割。研究人員隨即想到，可以合成一個包含特異性磷酸化位點的標簽，使其與固化的鈾酰離子結合，該系統可以在光切割后釋放出純化的無標簽重組蛋白。
Møllegaard決定先將這一系統開發成為C端標簽，因為此前的工作顯示鈾酰切割發生在磷酸化*的N端，這樣就可以實現C端標簽的*切除。蛋白酶剪切無法*去除這樣的標簽，因為它的剪切發生在識別位點的C端。
研究人員選擇酪蛋白激酶CKII作為磷酸化標簽肽段的激酶，因為這種酶的磷酸化發生在識別序列N端的*上。他們設計的標簽序列是SSDDD，其中三個天冬氨酸負責與鈾酰結合，兩個*作為磷酸化位點。生物通 www.ebiotrade.com 
研究人員將該標簽的 C端與GFP融合，并在細菌中進行表達，隨后他們用CKII處理細菌的裂解物。研究顯示，磷酸化只發生在標簽中的*位點上。在與鈾酰- NTA-瓊脂糖珠混合時，磷酸化的GFP-tag與瓊脂糖珠發生了有效的特異性結合，而這樣的結合可以被磷酸鈉緩沖液洗脫。
為了研究鈾酰切割的具體情況，研究人員在細胞裂解物中對GFP-tag進行了CKII處理，然后在溶液中加入鈾酰，并進行了UV照射。他們觀察到，蛋白標簽出現了光依賴性的切除。不過ESI-MS顯示，GFP的zui后一個賴氨酸也被切掉了，說明該系統還需要進一步優化，讓剪切位點更為。
現在，Møllegaard正在嘗試對結合在鈾酰- NTA-瓊脂糖珠上的融合蛋白進行光切割，以便將其發展成為蛋白分離和標簽切除的一步法系統。“還有許多步驟有待優化，舉例來說，我們需要優化紫外線照射，以便在純化柱上進行更有效的光切割，”Møllegaard指出。

參考文獻：
1. Fujii Y., M. Kaneko, M. Neyazaki, T. Nogi, Y. Kato, and J. Takagi. 2014. PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affinity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin. Protein Expr Purif. 95:240-7. doi: 10.1016/j.pep.2014.01.009. Epub 2014 Jan 28. 生物通 www.ebiotrade.com 
2. Islam, T., J. M/ Aguilar-Yañez, J. Simental-Martínez, C. I. Ortiz-Alcaraz, M. Rito-Palomares, and M. Fernandez-Lahore. 2014. A novel strategy for the purification of a recombinant protein using ceramic fluorapatite-binding peptides as affinity tags. J Chromatogr A. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2014.02.079. Available online 5 March 2014 
3. Zhang, Q., T.J. Jørgensen, P.E. Nielsen, and N.E. Møllegaard. 2014. A phosphorylation tag for uranyl mediated protein purification and photo assisted tag removal. PLoS One.