內皮素轉化酶抑制劑治療腦血管痙攣的免疫組化研究

【資料簡介】

【摘要】目的： 應用免疫組化方法探討ET1在蛛網膜下腔出血（SAH）引起的腦血管痙攣（CVS）中的作用，以及［DVal22］大ET1（1638）對基底動脈壁 ET1表達的影響和不同用藥方式和時機的作用是否相同.方法： 采用枕大池雙注血法制備36只兔SAH后CVS模型，隨機分成生理鹽水對照組、SAH組、腦池給藥預防組、靜脈給藥預防組、腦池給藥治療組和靜脈給藥治療組.全部實驗動物于注血后7 d進行灌注固定，留取基底動脈和腦組織標本，進行免疫組織化學染色，觀察ET1的免疫表達.結果： ET1免疫陽性標記顆粒在生理鹽水對照組散在不規則表達，而在SAH組血管壁各層都有重度表達.用藥預防和治療組免疫染色強度基本一致，血管壁各層的ET1免疫反應強度介入SAH和對照組之間.結論： ［DVal22］大ET1（1638）可明顯抑制基底動脈壁ET1的免疫表達，無論腦池還是靜脈給藥均能夠達到有效地預防和治療SAH后CVS.

　　【關鍵詞】 蛛網膜下腔出血；血管痙攣，顱內；內皮素轉化酶抑制劑；內皮縮血管肽1；免疫組織化學

　　0引言

　　蛛網膜下腔出血（SAH）后腦血管痙攣（CVS）所導致的缺血性損害是顱內破裂動脈瘤死亡率和致殘率居高不下的主要原因［1］，但腦血管痙攣的確切發病機制尚不十分清楚.大量的實驗研究表明含有21個氨基酸、具有明顯劑量依賴，可持久收縮血管的多肽――內皮素（ET1）是SAH后CVS的發生過程中的重要致病因子.SAH后血液溶解產物通過各種途徑促進了ET1的釋放和生物合成，同時破壞和抑制一氧化氮（NO）的生物學作用，使維持腦血管正常舒張和收縮的平衡遭到了破壞，導致CVS發生.實驗研究證實內皮素轉化酶ECE抑制劑［DVal22］大ET1（16~38）可有效預防SAH后CVS的發生［2］，但其是否可以治療或逆轉SAH后CVS，不同途徑給藥是否可以同樣發揮預防和治療SAH后CVS，對基底動脈內膜和平滑肌中ET1的免疫表達有何影響均未見報道.本研究的目的是探討［DVal22］大ET1（16~38）對基底動脈壁 ET1的表達的影響以及不同用藥方式和時機的抑制作用是否相同.

　　1材料和方法

　　11材料

　　二級新西蘭白兔36只（第四軍醫大學實驗動物中心），雌雄不限，體質量26～32 kg，平均28 kg，2×10-5mol/L內皮素轉化酶（ECE）抑制劑（DVal22）大ET1（1638）生理鹽水溶液（Peptides Co. 美國），1∶300兔二抗PBS溶液（博士德，武漢），1∶200抗內皮素抗體PBS溶液（博士德，武漢），40 g/L的多聚甲醛固定液，1∶500 ABC復合物，DAB硫酸鎳胺顯色液.

　　12方法

　　121動物模型白兔枕部剃毛，消毒后于枕部中線作一直切口，長25 cm，銳性分離直達寰枕筋膜，充分顯露寰枕部，用18G*與軀體成角約30°穿刺枕大池，退出針芯，此時可見清亮CSF流出.取自體股動脈的非抗凝血25 mL，緩慢注入枕大池內.退出*，局部壓迫后，縫合切口，取側臥頭低30°位放置30 min，使血液集積在腦基底池.注血后48 h，由兔耳*動脈取血25 mL，按上述方法，再次注入枕大池內.

　　122分組將36只動物模型隨機分為6組： ① 對照組，枕大池內注射生理鹽水25 mL，48 h后再次注射25 mL生理鹽水.② SAH組，注射自體動脈血25 mL，48 h后再次注射25 mL自體動脈血.③ 腦池給藥預防組，枕大池內注射自體動脈血25 mL.隨后注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38）生理鹽水，48 h后先后注射25 mL自體動脈血和05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.④ 靜脈給藥預防組，枕大池內注射自體動脈血25 mL.同時靜脈內注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.48 h后枕大池再次注射25 mL自體動脈血，靜脈內注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.⑤ 腦池給藥治療組，枕大池內注射自體動脈血25 mL.24 h后枕大池內注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.注血48 h后枕大池內再次注射25 mL自體動脈血，24 h后枕大池注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.⑥ 靜脈給藥治療組，枕大池內注血25 mL.24 h后靜脈內注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.注血48 h后枕大池內再次注射25 mL自體動脈血，24 h后靜脈內注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.

123灌注固定所有白兔飼養7 d后，以10 g/L的戊*鈉麻醉（30 mg/kg），打開胸腔，撥開*，暴露心臟，剪開右心房放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動脈用*固定，先輸入生理鹽水將血管內的血沖洗干凈，再注入40 g/L的多聚甲醛固定液2000 mL灌流固定.

　　124免疫組織化學標本將基底動脈標本放入200 g/L蔗糖液中4℃下浸泡24 h，直至組織*沉底.將標本在恒冷箱切片機制作成14 μm切片，應用ABC法進行免疫組織化學染色，在光鏡下進行觀察.

　　2結果

　　實驗動物在攝食、飲水、睡眠及體質量等指標與對照組動物未見有何差別，枕大池注血及［DVal22］大ET1（1638）治療后未發現神經功能障礙.灌注取標本，肉眼下可見凝血塊主要聚積在腦基底池和基底動脈周圍.

　　對照組標本可見基底動脈內膜細胞上可見散在不規則ET1免疫陽性標記顆粒，平滑肌內則未見免疫陽性標記顆粒（Fig 1A）.而珠網膜下腔出血組動物的基底動脈的內皮細胞、平滑肌和外膜上ET1重度染色，以內皮細胞zui為突出（Fig 1B）.而其他4組，腦池給藥預防組、靜脈給藥預防組 、腦池給藥治療組和靜脈給藥治療組免疫染色強度基本一致，血管內皮細胞、平滑肌和外膜ET1免疫反應明顯變淡，仍可見免疫陽性標記顆粒，血管壁各層的ET1免疫反應強度介入珠網膜下腔出血組和對照組之間（Fig 1C）.鄰近基底動脈的腦組織（腦干）在各組中未見明顯的免疫染色.

　　3討論

　　ET1是ET家族中活性的多肽，在活體和離體實驗中均可引起一種劑量依賴性，持久的縮血管反應［3］.在SAH后應激反應可使全身血管內皮合成和分泌增加，引起血漿中ET含量升高，此情形下腦血管內皮合成和分泌的ET有可能穿過基底膜作用于平滑肌， 引起腦血管痙攣［4］. Ohkuma等［5］應用免疫組化分析前ET原反義寡DNA治療犬SAH后CVS時發現，空白對照組血管EC，中層SMC和外膜ET1產物的表達弱而不規則，而SAH后 2、4和7 d腦血管EC，SM和外膜均可見到不同程度的免疫反應性ET1產物.Shigeno等［6］采用免疫組化染色發現正常基底動脈僅在內皮上可見散在的ET染色，而SAH后3 d內層全層可見過度的免疫表達.放射菌素D（非特異性ECE抑制劑）治療組，ET的免疫反應被抑制，SAH組表達明顯.以上研究說明ET1與腦血管痙攣有明確的關系.

　　本研究通過免疫組化法證實對照組內皮細胞內可見散在的，不規則的ET免疫染色，SAH后7 d EC 、SM和外膜重度染色，以ECzui為突出.［DVal22］大ET1（16~38）預防組，治療組及不同用藥方法組，ET染色淡，介于對照組和SAH組之間，而且不同途徑給予的治療組和預防組之間沒有明顯的差別.此結果表明： SAH后血液溶解產物可能刺激了EC、SM和外膜內源性ET的表達,破壞了ET1和NO之間的平衡，導致CVS發生；證實內源性ET1在CVS發展過程發揮了重要作用；［DVal22］大ET1（16~38）有效地阻斷了無活性大ET1轉化成具有活性的ET1，使ET1表達下降，不僅能夠預防腦血管痙攣的發生，同時能夠治療珠網膜下腔出血引起的腦血管痙攣.但是本實驗僅對SAH后7 d ET的免疫反應進行了觀察，而SAH后不同時間內的表達規律如何？［DVal22］大ET1（16~38對ET1的免疫反應有何影響？需進一步研究.

　　那么SAH后引起收縮的ET究竟來源何處？有研究證實顱底大血管壁中有ET，存在于內皮及平滑肌上，且SAH后早期ET明顯增加.有人發現OxyHb能刺激培養的血管內皮合成ET增加，且主要向基底面分泌［7］，故認為可引起基底膜ET增加，ET穿過基底膜作用于平滑肌細胞.此外SAH后CSF，血管及下丘腦部位ET含量升高，CVS中ET含量變化與下丘腦部位含量變化有良好的相關性［8］；從蛛網膜下腔阻斷ET作用，能有效地預防和逆轉CVS，說明ET作用血管是從CSF中血管外膜方面，且CSF中ET可能來源于下丘腦［9］.而本實驗無論是從珠網膜下腔還是從靜脈內給藥都能達到良好的效果，我們考慮ET1可能來自血管內皮細胞和下丘腦兩個部位. 此設想有待進一步研究.

　　【參考文獻】

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