柱式植物葉綠體DNAout

【資料簡介】

柱式植物葉綠體DNAout
產(chǎn)品及特點 本試劑盒是結(jié)合植物葉綠體純化試劑盒和柱式植物DNA抽提試劑盒而推出的新興產(chǎn)品，專門用于植物葉綠體DNA的快速提取。它具有下列特點：
1. 純度高，不含污染和抑制劑，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsalite analysis等各種后續(xù)分子生物學(xué)實驗。
2. 產(chǎn)率一般在3-30 ug/100 mg樣品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段長度一般在40-50 Kb左右。
3. 本產(chǎn)品足夠15次提取，每次可處理30g葉片。
4. 已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可能需要優(yōu)化條件）。
5. 不會發(fā)生離心柱堵塞現(xiàn)象。
規(guī)格及成分 成 份 15次大盒包裝
植物葉綠體純化試劑盒（CAT#:120308） 15次（一套）
溶液A 15 mL
溶液B 7.5 mL
溶液C 30 mL
離心吸附柱 15套
通用洗柱液 15 mL
DNA洗脫液2.0 10 mL
使用手冊 1份
其中，植物葉綠體提取試劑盒的成分如下：
成 份 15次大盒包裝
勻漿液成分一 250 mL×2
勻漿液成分二（干粉） 3 g
Percoll 100 mL
帶柄尼龍濾膜 1個
使用手冊 1份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存, 保存期限一年。
自備試劑 去離子水
使用方法 注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在4℃預(yù)冷。離心時一定要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。
一：葉綠體的純化
1. 實驗前1-2天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片的放置時間也不能超過一天。
2. 新鮮（實驗當(dāng)天）制備勻漿液：將自備的去離子水與勻漿液成分一按4：1的比例混合，然后在混合液中加入勻漿液成分二干粉到終濃度0.1%（每100 mL中加入0.1 g干粉），搖晃溶解后所得溶液即為勻漿液，冰上預(yù)冷待用。一次實驗（從30 g葉片提取葉綠體）所需要的勻漿液體積跟材料不同而不同。
3. 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在適量的預(yù)冷的勻漿液中（每克葉片加4 mL勻漿液，但對煙草和大豆，每克葉片需要加4 mL勻漿液）。
4. 將浸泡了葉片的勻漿液轉(zhuǎn)移到Waring勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿10秒。注意：除Waring勻漿機(jī)外，還可以選擇Dounce玻璃勻漿器，Polytron勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等裂解細(xì)胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小，需分成很多小份單獨勻漿，然后再匯集。
5. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，可先將濾液收集到預(yù)冷的200 mL量筒中，再等分到4個預(yù)冷的50 mL的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過35 mL）。帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。
6. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 200 g離心3分鐘（對菠菜，白菜和萵筍材料）或400 g離心1分鐘（對甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。
7. 將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個新的、預(yù)冷的50 mL塑料離心管中。
8. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 1000 g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體，呈淺綠色。
9. 在沉淀中加入1.5 mL預(yù)冷的勻漿液，手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意：重懸時避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。沉淀下有白色淀粉屬于正常現(xiàn)象，但重懸葉綠體時避免將白色淀粉重懸。
10. 將4管葉綠體重懸液匯集（共約6 mL），得到葉綠體粗提液，如果直接用于葉綠體DNA純化（容易有細(xì)胞核DNA污染），則在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 1000 g離心7分鐘，小心棄上清，沉淀為葉綠體，用于DNA純化。
11. 如果需要無污染的葉綠體DNA，就需要用密度梯度離心法將完整的葉綠體和其他污染物進(jìn)一步分離。具體操作步驟是：在50 mL塑料離心管中先加入6 mL勻漿液成分一和4 mL Percoll，充分混合均勻。在其液面上小心鋪上葉綠體粗提液。在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上4℃ 1000 g離心8分鐘，管底綠色沉淀為完整的葉綠體。小心將上清倒出后，用于葉綠體DNA純化。
二：葉綠體DNA的純化
12. 將600 uL溶液A加入到葉綠體沉淀中后充分吹打混勻。
13. 加入300 uL 溶液B，震蕩混勻10-30秒。注意：溶液B非常粘稠。
14. 加入200 uL自備氯仿，震蕩混勻10-30秒。
15. 12,000 rpm室溫離心2分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液（約0.8 mL）到一個新的3-5 mL離心管中，避免觸及中間層的白膜，可留少量上清不取。
16. 加入1.5倍體積（約1.2 mL）的溶液C，顛倒混勻后先轉(zhuǎn)移0.7 mL到離心吸附柱中，室溫放置至少2分鐘。12,000 rpm室溫離心1分鐘，DNA將吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。
17. 再將剩余的溶液按上步方法上柱。
18. 將0.5 mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12,000 rpm室溫離心1分鐘，棄穿透液。
19. 重復(fù)上步操作一次。
20. 空甩半分鐘去除殘留液體。
21. 將離心吸附柱放置在一新的1.5 mL塑料離心管中，加50-100 uL DNA洗脫液2.0，室溫放置3-5分鐘。
22. 12,000 rpm室溫離心1分鐘即得植物葉綠體DNA溶液。
23. 由于本產(chǎn)品使用的離心吸附柱吸附DNA的能力較強(qiáng)，可以重復(fù)上步操作一次，以洗脫得到更多的DNA。直接取5-10 uL電泳檢測，其余放冰箱備用。