總RNA抽提實驗操作技巧和步驟

【資料簡介】

[實驗原理]

Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，裂解細胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產量十分有用。

無論是人、動物、植物還是細菌組織，各種樣品zui大使用量（1ml Trizol），動物組織（ 50mg），植物組織（100 mg），絲狀真菌（ 100mg），動物細胞（5×106～1×107），酵母（1×107） 。

TRIZOL試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優勢核糖體RNA條帶位于~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 （tRNA, 5S）。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值≥1.8 。

[實驗用品]

【實驗耗材】

1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。酒精擦拭，頭部重點，紫外線照射。

2、吸頭：1ml、200μl、20μl

3、勻漿管：5ml

4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、試劑瓶：2個60ml的棕色廣口試劑瓶。小瓶（分裝無水乙醇，高壓的DEPC水，-20°C保存）。

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水

11、鋁制飯盒：4個

12、塑料小飯盒：1個

13、大瓷缸：2個

14、錫泊紙：一卷

15、卷紙：2卷

16、三角燒瓶：帶蓋，稍大（融瓊脂糖）

【實驗儀器】

天平、振蕩器、高速離心機、0.5～10ul、20～200ul、100～1000ul加樣器。

【自備試劑】

DEPC（焦碳酸二乙酯）,氯仿，異丙醇，無水乙醇，0.05～0.1%DEPC-H2O，75%乙醇，TE緩沖液，瓊脂糖。

RNA抽提的準備工作

【試劑配制】

1.DEPC水： 1ml+1000ml雙蒸水=1‰ DEPC水，1000ml容量瓶中靜置4小時。

2.75%乙醇：無水乙醇+DEPC水，-20℃保存（DEPC水需先高壓）

3.氯仿：棕色瓶

4.異丙醇：棕色瓶

【器具處理與準備】

1.塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）

先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，小槍頭需打入DEPC水，室溫過夜，高壓，烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）。膠塞同樣處理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*漂洗干凈后高壓滅菌備用。

2.玻璃制品：

泡酸過夜，沖洗干凈，1 ‰DEPC過夜，蒙錫紙，150°C烘烤4h，180°C，2h。或泡酸過夜，沖洗干凈后高溫烘烤，1 ‰DEPC過夜，高壓。盛裝乙醇，DEPC水用。

3.勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）

[實驗內容和方法]

一、抽提

（一）組織抽提

1.組織取材后用滅菌的錫箔紙包好保存于液氮。實驗時，在液氮中將組織研磨成粉末，趁液氮未揮發將粉末轉移到EP管，室溫5000rpm離心去上清。每50-100mg組織，加入1ml Trizol。

2.若是新鮮標本經勻漿后轉移離心管，加入1ml Trizol。

3.若組織量（1～10 mg）或細胞數很少（102～104），在樣品中加入800 ul Trizol反復抽吸均勻，再加入糖原（終250ug/ml）,劇烈振蕩或用勻漿器勻漿。

4.在勻化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60～70°C保存至少一個月。

（二）細胞抽提

1.倒掉培養基，PBS洗，直接將1ml Trizol 注入培養瓶（5×106），反復抽吸均勻。

2.或收集細胞后加入Trizol 反復抽吸均勻。

二、分相

3.在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿（為Trizol總體積的1/5）,振蕩混均30秒，室溫下靜置5分鐘.

4. 12000 rpm 15分鐘4°C,分相為三層。上層：RNA（約為Trizol的60%）;中間：DNA;下層:蛋白質（酚-氯仿）。

5.小心吸取上清液，轉移到另一EP管中。1ml裂解物產生的上清液體積約為0.4～0.6 ml。有機相和中間層含有DNA和蛋白質,避免觸及。

三、RNA沉淀

6.上清液加入約0.5ml的異丙醇,振蕩混均30秒。室溫下靜置10分鐘。

7.離心12000rpm 10分鐘4°C。

8. RNA沉淀將在離心底的側面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA沉淀。

四、RNA清洗

9.離心管加入1ml 預冷的75%乙醇（1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA）,振蕩混均30秒，使沉淀振蕩起來，室溫12000rpm×1～2分鐘。（有文獻稱不超過7500g離心）。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復以上清洗步驟一次。在75%乙醇中，RNA在4℃至少保存1周，-20℃至少保存1年。

10.室溫選擇流動性小，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能*干燥（5～10分鐘）。用DEPC水15μl溶解沉淀，55-60℃孵育10～15分鐘。

11.測量OD值后，樣品放置-70℃保存，一個月

五、RNA、DNA濃度的計算

取78μl DEPC水加2μl 第10步液體，則稀釋倍數為40倍。

【RNA】=A260 X 40 X n/1000μg/μl

【DNA】=A260 X 50 X n/1000μg/μl（n為稀釋倍數）

分離RNA的理想效果是A260/A280=1.8～2.0

A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值

[注意事項]

1. RNA產量：每1 mg組織或1×106培養細胞預期的RNA產量

（1）肝和脾，6—10μg

（2）腎，3—4μg

（3）骨骼肌和腦組織，1—1.5μg

（4）胎盤，1-4μg

（5）上皮細胞（1×106 ，8—15μg cultured cells）

（6）纖維母細胞（1×106 ，5—7μg cultured cells）

2.電泳檢測: 制備甲醛變性，1%瓊脂糖凝膠快速電泳，25ug/lane，65V，2.5h，檢測RNA分子完整性，觀察18S、28S條帶。

3. RNA沉淀*干燥，會地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值<1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA，并在55～60°C下孵育10分鐘，當RNA以后要用于酶切反應時，避免使用SDS。

對于胰腺，腎等組織中RNase含量很高，沉淀用去離子甲酰胺溶解，–70°C保存。

4.分離RNA的理想效果是A260/A280=1.8～2.0

【分離膠范圍】<500bp 1.2～1.5%

>10 kp 0.3～0.7%

二者之間 0.8～1.0%

【分析和定量】紫外分光光度計測定A260及A280來定量分析RNA的純度及濃度。用什么稀釋的RNA，就用其調零。

5.預防RNA酶污染

6.在分相步驟吸取上清液過程中，和清洗步驟吸棄上清液過程中，都應在不觸及其他相或沉淀的前提下吸取盡可能多的上清液。

7.臺式離心機zui大能達到2,600×g的離心力，如果將離心時間延長到30-60分鐘可以滿足操作。

8.當TRIZOL用量少于2ml時建議使用清潔的一次性的聚丙材質試管。TRIZOL用量較大時，可以使用玻璃試管（Corex）或聚丙材質試管，事先檢驗以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。 離心前小心平衡試管。離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟膜封口，聚丙烯管必須蓋緊。

9. 用TRIZOL抽提RNA時要戴手套和護眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學通風櫥完成操作。避免呼吸道吸入。

【疑難解答】

一、無RNA沉淀

1. 勻漿不*：勻漿不*時，基因組DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地釋放到溶液中。

2..沉淀不*：從小于2×105動/植物細胞、小于2mg動物組織、小于4mg

植物組織或RNA含量低的動/植物組織中提取RNA時，勻漿體積太大，將造成RNA過分稀釋而不能沉淀下來。當從這樣的樣品中提取RNA時，應按比例減少抽提溶液。

二、抽提率低

1. 系統超負荷：如果過多增加單位體積內的樣品量，將引起系統超負荷。系統超負荷常導致勻漿不*、單位體積內的DNA和蛋白質所占比例增大，使RNA不能有效地釋放到上清中。系統超負荷還會導致相分離困難，降低RNA沉淀效率.

2.樣品均化或裂解不*: 勻漿不*時，RNA分子易被蛋白質和基因組DNA復合物包裹，不能被有效釋放。

3.終RNA不*溶解:未溶解的RNA丟失。

4.樣品未及時處理或細胞生長過度：樣品分離后短時間內細胞內RNA酶被激活，細胞生長過度同樣會激活細胞內RNA酶，若不及時提取RNA，大部分RNA會被降解。若樣品暫時不作RNA提取，應立即用液氮冷凍*，置-80℃貯存。

三、A260/A280 比率 <1.65

1.在分光光度計測量前用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。

2.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。

3.勻漿化后樣品沒有在室溫下放置5分鐘。

4.分離的水樣層中污染有層。

5.終RNA沒有*溶解。

四、RNA降解

1.從動物體取下的組織沒有立即進行抽提或冰凍保存。

2.用于抽提的樣品，或抽提的RNA樣品保存于–5—–20°C，而不是存放于–70°C。

3.細胞經消化而分散。

4.水溶液或試管污染有RNA酶。

5.用于瓊脂糖凝膠電泳的福爾馬林pH低于3.5。

6. RNA在水溶液中呈酸性，易自發水解，應溶于TE，-20℃以下保存。?

五、DNA污染

1.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。

2.用于抽提的樣品包含有機溶媒（如乙醇，DMSO），強緩沖液或堿性溶液。

六、蛋白多糖和多糖污染

下述的對RNA沉淀方法改進能從抽提的RNA中移去復合污染。以勻漿化時每1 ml TRIZOL為例，在水樣層中加入0.25 ml異丙醇后再加入0.25 ml的高鹽溶液（0.8 M檸檬酸鈉和1.2 M NaCl）。將終溶液混勻，離心并繼續進行前述的抽提操作。改進后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。對于含有大量多糖的植物，要抽提其RNA將改進后的沉淀法和在zui初勻漿化時多加一次離心（RNA 抽提指南，可選方案）合并使用是十分必要的。

另外，關于實驗所用的細胞，如果有新鮮的就用新鮮的，因為使用凍存過的細胞實驗結果會比較差。如果沒辦法馬上進行RNA提取實驗，建議先加入抽提試劑將樣品裂解之后在細胞凍存。