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*抗體,Anti-streptomycin
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關 鍵 詞 | *抗體,Anti-streptomycin,生物試劑,抗體 |
- 【資料簡介】
從免疫血清純化抗體
1. 剪取一小條0.45 μm 的硝酸纖維膜,置于1.5ml eppendorf 管中,浸沒于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中,5 min。
2. 取出膜,置于濾紙上干燥。
3. 將膜放置于裝有1 ml Buffer A 的eppendorf 管,輕輕震蕩混勻30 min。
4. 移去Buffer A,用新鮮的Buffer A 洗一次,將膜浸沒于0.8-1 ml 相應的抗血
清中,1-2 h, 于混勻器上輕輕震蕩混勻。
5. 移去血清,用PBS 洗膜,4 次,每次5 min。
6. 洗脫抗體
新配置100 mM *(pH 2.5)抗體洗脫液,將膜置于洗液中,手輕搖
混勻2 min,迅速將洗液轉移至裝有100 μl 1 M Tris(pH 8.0)中和,使抗體
復性。第1 次洗脫用400 μl 抗體洗脫液,第2,3 次用200 μl。
7. 往洗脫下來的液體中加入100 μl Buffer A 以穩定抗體,并分裝成30 μl 每管,
于-20℃保存。
注:所有步驟均在室溫完成。精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術,避免蛋白變性。如分離IgG時,多結合使
用鹽析法與離子交換法,以求純化。提取IgM的方法也很多,如應用凝膠過濾與制備電泳法,或離子交換與凝膠過濾等。
一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理鹽水溶解沉淀,再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此時,(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復上述第二步過程1~2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對PBS充分透析、換液3次,至萘氏試劑測透析外液無黃色,即無NH4+為止。
取透析袋內樣品少許作適當倍數稀釋后,以751型紫外分光光度計測定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多,如蛋白質的濃度,鹽的濃度,飽和度和pH,溫度等都可影響鹽析的結果,操作時要充分注意(參閱本章 第二節 )。
二、冷酒精沉淀法
分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水,調節 pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下,加預冷的酒精(-20℃)到zui終濃度為20%,保持在-5℃。產生的沉淀(A),含有大多數種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸調節 pH到5.1,產生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液內。調節 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到zui終濃度為25%,維持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同動物,IgG分離的條件和產量略有不同。見表2-5。從沉淀(B)可按下述方法進一步分離出IgA和IgM的混合物:將沉淀(B)懸浮在0℃ 水中,調節 pH到5.1,離心去除不溶的蛋白。調節 上清液離子強度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%,保持在–2℃或-3℃低溫,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種 pH 沉淀條件 IgG產量
酒精濃度(%) 離子強度
人 5.1 15. 0.01 65
山羊 5.2 0 0.01 65
家兔 5.2 10 0.01 70
大鼠 5.0 15 0.01 50
豚鼠 5.1 15 0.01 70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉變為OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為pH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。PH7.2~7.4的環境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過柱層析,γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG.
*抗體,Anti-streptomycin (一)操作步驟
1.DEAE-Sephadex
A-50預處理 稱DEAE-SephadexA-50(下稱A-50)5g,懸于500ml蒸餾水內,1h后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例,將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中,攪勻,靜置30min,裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾,并反復用蒸餾水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作過程處理,zui后以0.5mol/LNaOH 再處理一次。處理完后,將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過夜 。
2.裝柱
(1)將層析柱垂直固定于滴定架上,柱底墊一圓形尼龍紗,出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。
(2)將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2~3cm高時,開啟出水口螺旋夾,控制流速1ml/min,同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。
(3)關閉出水口,待A-50凝膠*沉降后,柱面放一圓形濾紙片,以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3.平衡
啟開出水口螺旋夾,控制流速12~14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強度,兩者達到一致時關閉出水口,停止平衡。
4.加樣及洗脫
啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾,使柱中液體緩慢滴出,當柱面液體與柱面相切時,立即關閉出水口,以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應<床體積2%,蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內,至與柱面相切時,立即關閉下口,以少量洗脫液洗柱壁2~3次;再放開出水口,使洗液進入床柱,隨后立即于柱面上加入數毫升洗脫液,緊塞柱上口,使整個洗脫過程成一密閉系統。并控制流速12~14滴/min。
5.收集
開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
6.測蛋白
以751型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm, 與OD260nm,按公式計算各管蛋白含量 。并以OD280nm為縱座標,以試管編號為橫座標,繪制洗脫曲線。
7.合并、濃縮
將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并,以PEG(MW6000)濃縮至所需體積,加入0.02%NaN3防腐,于4℃保存備用。長期保存時應貯于-40℃冰箱。
8.A-50凝膠的再生
在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達到再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時,以*洗2次,再置50℃溫箱烘干,裝瓶內保存。
(二)注意事項
(1)柱的選擇:從理論上說,只要柱足夠長,就能獲得理想的分辨率,但由于層析柱流速同壓力梯度有關,柱長增加使流速減慢,峰變寬,分辨率降低。柱的直徑增加,使流體流動的不均勻性增加,分辨率明顯下降。
(2)純化過程必須嚴格控制緩沖液的pH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后,才能進行柱層析。
(3)所裝的柱床必須表面平整,無溝流及氣泡,否則應重裝。
(4)洗脫過程中應嚴格控制流速,切勿過快。
(5)上樣的體積要小,濃度不宜過高。
(6)加樣及整個洗脫過程中,嚴防柱面變干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 親合層析純化
IgG及IgG亞類
(一)原理
葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結合的能力,并與不同IgG亞類的結合力有所差別。改變pH及離子強度可洗脫結合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亞類,可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。
(二)操作步驟
用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠,15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠,(用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌)。
↓
裝柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡。標本可用硫酸銨粗提物,先10000g離心除去雜質,必要時用0.22μm濾膜過濾,上樣前用1mol/L pH9.0 Tris 液調整標本液pH至8.1或對平衡液透析過夜。
↓
加樣,一般按25~30mg IgG/g濕膠比例加樣,室溫作用15min,用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗,到淋洗液OD值為<0.02。
↓
用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫,流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用pH4.0;純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。
↓
用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時,用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。
↓
收集洗脫液測OD值,根據實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定。
(三)試劑器材
(1)SPA-Sepharose L-4B (pharmacia)
(2)磷酸緩沖液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
(3)枸櫞酸緩沖液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0
(4)1mol/L pH9.0 Tris溶液
(5)再生緩沖液:①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl調整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸鈉含0.5mol/L NaCl調整pH至4.5+0.02%NaN3。
(四)注意事項
(1)SPA-Sepharose CL-4B凝膠價格昂貴,可再生后反復使用10~20次左右。方法:先用10倍柱體積0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;再用10倍柱體積0.1mol/L pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡,4℃貯存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B親 合層析法還可用于:①除去抗體液中IgG,檢測非IgG抗體(如IgM)的生物學活性;②除去木瓜蛋白酶或*水解IgG后的Fc段;③吸收或純化免疫復合物。
(3)狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結合的能力。
五、和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體
從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親合層析等。應用TSK DEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快,回收率和得率高 ,而且保持良好的生物學活性。
(一)原理
根據離子交換原理,將經硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結合于層析柱上,通過增加洗
脫液中的離子強度,洗脫并收集蛋白峰。
(二)操作步驟
腹水離心10000 g,10min,除去細胞和雜質,在4℃下逐滴加入飽和硫酸銨溶液,使終濃度為40%飽和硫酸銨
↓攪拌20~30min
離心,沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS,對緩沖液A(pH8.5,
20mmol/L Tris緩沖液)透析除鹽
↓4℃過夜
用帶有1000μl樣品環的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經緩沖液A液平衡的TSK
DEAE SPW離子交換層析柱
↓
洗脫流速1ml/min
0~1min :0→5%緩沖液B(20nmol/L
Tris, Ph 8.5,含2.0
mol/L醋酸鈉)
1~2 min( 線性梯度洗脫):5→20%緩沖液B
20~22min:20→0%緩沖液B
↓
洗脫液用紫外280nm進行監測
↓
收集蛋白峰,進行含量、純度和活性測定
(三)試劑和器材
(1)TSK
DEAE SPW離子交換層析柱 (75mm×7.5mm,Bio
Rad)
(2)液相色譜儀(包括控制系統、溶劑傳遞系統、高壓加壓活門和紫外280nm監測系統)
(3)PBS,緩沖液A和B。
(四)注意事項
(1)所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2μm濾膜過濾。
(2)在本實驗條件下,IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11-12min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb
的存留時間(retention
time)有所差異。
【附錄】
制備單克隆抗體常用的試劑
1.RPMT-1640培養液 其中含2mmol/L *,25
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L
RPMT-1640*培養液 上述溶液加10%~20%滅活小牛血清
3.HT母液×100
次黃嘌呤(H)
1.0×10-2mol/L
136.1mg
胸腺嘧淀核苷(T) 1.6×10-3mol/L 38.8mg
蒸餾水 100ml
4. A母液×100
氨基喋呤(A) 4×10-3mol/L
1.76mg
蒸餾水 90.0ml
1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L
HCl 0.5ml,再補加蒸餾水至100ml 。
5.HAT選擇培養液
RPMI-1640培養液
80ml
滅活小牛血清 20ml
HT母液×100
1ml
A母液×100
1ml
用5%NaOH調節 pH至7.4左右。
6.HT培養液
RPMI-1640培養液
80ml
滅活小牛血清
20ml
HT母×100
1ml
用5%NaOH調節 pH至7.4左右。
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