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*抗體,Anti-streptomycin

2012年12月19日 18:11:34人氣:373來(lái)源:上海安研商貿(mào)有限公司

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關(guān) 鍵 詞 *抗體,Anti-streptomycin,生物試劑,抗體
【資料簡(jiǎn)介】

 *抗體,Anti-streptomycin

從免疫血清純化抗體
1. 剪取一小條0.45 μm 的硝酸纖維膜,置于1.5ml eppendorf 管中,浸沒(méi)于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中,5 min。
2. 取出膜,置于濾紙上干燥。
3. 將膜放置于裝有1 ml Buffer A 的eppendorf 管,輕輕震蕩混勻30 min。
4. 移去Buffer A,用新鮮的Buffer A 洗一次,將膜浸沒(méi)于0.8-1 ml 相應(yīng)的抗血
清中,1-2 h, 于混勻器上輕輕震蕩混勻。
5. 移去血清,用PBS 洗膜,4 次,每次5 min。
6. 洗脫抗體
新配置100 mM *(pH 2.5)抗體洗脫液,將膜置于洗液中,手輕搖
混勻2 min,迅速將洗液轉(zhuǎn)移至裝有100 μl 1 M Tris(pH 8.0)中和,使抗體
復(fù)性。第1 次洗脫用400 μl 抗體洗脫液,第2,3 次用200 μl。
7. 往洗脫下來(lái)的液體中加入100 μl Buffer A 以穩(wěn)定抗體,并分裝成30 μl 每管,
于-20℃保存。
注:所有步驟均在室溫完成。

 

精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術(shù),避免蛋白變性。如分離IgG時(shí),多結(jié)合使 
用鹽析法與離子交換法,以求純化。提取IgM的方法也很多,如應(yīng)用凝膠過(guò)濾與制備電泳法,或離子交換與凝膠過(guò)濾等。
一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清,以xml生理鹽水溶解沉淀,再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此時(shí),(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復(fù)上述第二步過(guò)程1~2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白,以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對(duì)PBS充分透析、換液3次,至萘氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色,即無(wú)NH4+為止。
取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,以751型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多,如蛋白質(zhì)的濃度,鹽的濃度,飽和度和pH,溫度等都可影響鹽析的結(jié)果,操作時(shí)要充分注意(參閱本章 第二節(jié) )。
二、冷酒精沉淀法
分離過(guò)程如下。血清加3倍體積的蒸餾水,調(diào)節(jié) pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下,加預(yù)冷的酒精(-20℃)到zui終濃度為20%,保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀(A),含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié) pH到5.1,產(chǎn)生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié) 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到zui終濃度為25%,維持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98%IgG。不同動(dòng)物,IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見(jiàn)表2-5。從沉淀(B)可按下述方法進(jìn)一步分離出IgA和IgM的混合物:將沉淀(B)懸浮在0℃ 水中,調(diào)節(jié) pH到5.1,離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié) 上清液離子強(qiáng)度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%,保持在–2℃或-3℃低溫,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動(dòng)物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種   pH   沉淀?xiàng)l件   IgG產(chǎn)量
    酒精濃度(%)   離子強(qiáng)度   
人   5.1   15.   0.01   65
山羊   5.2   0   0.01   65
家兔   5.2   10   0.01   70
大鼠   5.0   15   0.01   50
豚鼠   5.1   15   0.01   70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽(yáng)離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點(diǎn)為pH6.85~7.5),其余均屬酸性蛋白。PH7.2~7.4的環(huán)境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過(guò)柱層析,γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG.
 *抗體,Anti-streptomycin (一)操作步驟
1.DEAE-Sephadex
A-50預(yù)處理  稱DEAE-SephadexA-50(下稱A-50)5g,懸于500ml蒸餾水內(nèi),1h后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例,將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中,攪勻,靜置30min,裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾,并反復(fù)用蒸餾水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作過(guò)程處理,zui后以0.5mol/LNaOH 再處理一次。處理完后,將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過(guò)夜 。
2.裝柱
(1)將層析柱垂直固定于滴定架上,柱底墊一圓形尼龍紗,出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開(kāi)關(guān)。
(2)將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2~3cm高時(shí),開(kāi)啟出水口螺旋夾,控制流速1ml/min,同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。
(3)關(guān)閉出水口,待A-50凝膠*沉降后,柱面放一圓形濾紙片,以橡皮塞塞緊柱上口。通過(guò)插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3.平衡   
啟開(kāi)出水口螺旋夾,控制流速12~14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之pH值與離子強(qiáng)度,兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口,停止平衡。
4.加樣及洗脫   
啟開(kāi)上口橡皮塞入下口螺旋夾,使柱中液體緩慢滴出,當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí),立即關(guān)閉出水口,以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品(體積應(yīng)<床體積2%,蛋白濃度以<100mg為宜)。松開(kāi)出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi),至與柱面相切時(shí),立即關(guān)閉下口,以少量洗脫液洗柱壁2~3次;再放開(kāi)出水口,使洗液進(jìn)入床柱,隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液,緊塞柱上口,使整個(gè)洗脫過(guò)程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12~14滴/min。
5.收集  
開(kāi)始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
6.測(cè)蛋白   
以751型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD280nm, 與OD260nm,按公式計(jì)算各管蛋白含量 。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo),以試管編號(hào)為橫座標(biāo),繪制洗脫曲線。
7.合并、濃縮  
將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并,以PEG(MW6000)濃縮至所需體積,加入0.02%NaN3防腐,于4℃保存?zhèn)溆谩iL(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)貯于-40℃冰箱。
8.A-50凝膠的再生   
在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過(guò)程將A-50再處理一遍即達(dá)到再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時(shí),以*洗2次,再置50℃溫箱烘干,裝瓶?jī)?nèi)保存。
(二)注意事項(xiàng)
(1)柱的選擇:從理論上說(shuō),只要柱足夠長(zhǎng),就能獲得理想的分辨率,但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān),柱長(zhǎng)增加使流速減慢,峰變寬,分辨率降低。柱的直徑增加,使流體流動(dòng)的不均勻性增加,分辨率明顯下降。
(2)純化過(guò)程必須嚴(yán)格控制緩沖液的pH及離子強(qiáng)度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后,才能進(jìn)行柱層析。
(3)所裝的柱床必須表面平整,無(wú)溝流及氣泡,否則應(yīng)重裝。
(4)洗脫過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速,切勿過(guò)快。
(5)上樣的體積要小,濃度不宜過(guò)高。
(6)加樣及整個(gè)洗脫過(guò)程中,嚴(yán)防柱面變干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 親合層析純化 
IgG及IgG亞類
(一)原理
葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動(dòng)物IgG分子Fc段結(jié)合的能力,并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變pH及離子強(qiáng)度可洗脫結(jié)合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亞類,可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。
(二)操作步驟
用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠,15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠,(用玻璃漏斗過(guò)濾或置燒杯中洗滌)。

裝柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡。標(biāo)本可用硫酸銨粗提物,先10000g離心除去雜質(zhì),必要時(shí)用0.22μm濾膜過(guò)濾,上樣前用1mol/L pH9.0 Tris 液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^(guò)夜。

加樣,一般按25~30mg IgG/g濕膠比例加樣,室溫作用15min,用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗,到淋洗液OD值為<0.02。

用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫,流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用pH4.0;純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。

用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時(shí),用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。

收集洗脫液測(cè)OD值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要透析除鹽后進(jìn)行濃度、純度和活性測(cè)定。
(三)試劑器材
(1)SPA-Sepharose L-4B (pharmacia)
(2)磷酸緩沖液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
(3)枸櫞酸緩沖液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0   +0.02%   NaN30.1mol/LpH3.0 
(4)1mol/L pH9.0 Tris溶液
(5)再生緩沖液:①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸鈉含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至4.5+0.02%NaN3。
(四)注意事項(xiàng)
(1)SPA-Sepharose CL-4B凝膠價(jià)格昂貴,可再生后反復(fù)使用10~20次左右。方法:先用10倍柱體積0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;再用10倍柱體積0.1mol/L pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡,4℃貯存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B親 合層析法還可用于:①除去抗體液中IgG,檢測(cè)非IgG抗體(如IgM)的生物學(xué)活性;②除去木瓜蛋白酶或*水解IgG后的Fc段;③吸收或純化免疫復(fù)合物。
(3)狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結(jié)合的能力。
五、和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體
從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾和親合層析等。應(yīng)用TSK DEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快,回收率和得率高 ,而且保持良好的生物學(xué)活性。
(一)原理
根據(jù)離子交換原理,將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上,通過(guò)增加洗 
脫液中的離子強(qiáng)度,洗脫并收集蛋白峰。
(二)操作步驟
腹水離心10000 g,10min,除去細(xì)胞和雜質(zhì),在4℃下逐滴加入飽和硫酸銨溶液,使終濃度為40%飽和硫酸銨
↓攪拌20~30min
離心,沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS,對(duì)緩沖液A(pH8.5, 
20mmol/L Tris緩沖液)透析除鹽
↓4℃過(guò)夜
用帶有1000μl樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSK 
DEAE SPW離子交換層析柱

洗脫流速1ml/min
0~1min :0→5%緩沖液B(20nmol/L 
Tris, Ph 8.5,含2.0 
mol/L醋酸鈉)
1~2 min( 線性梯度洗脫):5→20%緩沖液B
20~22min:20→0%緩沖液B

洗脫液用紫外280nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)

收集蛋白峰,進(jìn)行含量、純度和活性測(cè)定
(三)試劑和器材
(1)TSK 
DEAE SPW離子交換層析柱 (75mm×7.5mm,Bio 
Rad)
(2)液相色譜儀(包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測(cè)系統(tǒng))
(3)PBS,緩沖液A和B。
(四)注意事項(xiàng)
(1)所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2μm濾膜過(guò)濾。
(2)在本實(shí)驗(yàn)條件下,IgG1峰一般在線性梯度洗脫開(kāi)始11-12min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb 
的存留時(shí)間(retention 
time)有所差異。
【附錄】
制備單克隆抗體常用的試劑
1.RPMT-1640培養(yǎng)液 其中含2mmol/L *,25 
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L 

RPMT-1640*培養(yǎng)液 上述溶液加10%~20%滅活小牛血清
3.HT母液×100
次黃嘌呤(H) 
1.0×10-2mol/L         
136.1mg
胸腺嘧淀核苷(T) 1.6×10-3mol/L        38.8mg
蒸餾水                    100ml
4. A母液×100
氨基喋呤(A)           4×10-3mol/L 
1.76mg
蒸餾水                     90.0ml
1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L 
HCl 0.5ml,再補(bǔ)加蒸餾水至100ml 。
5.HAT選擇培養(yǎng)液
RPMI-1640培養(yǎng)液 
             80ml
滅活小牛血清                20ml
HT母液×100                       
1ml
A母液×100                       
1ml
用5%NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4左右。
6.HT培養(yǎng)液
RPMI-1640培養(yǎng)液                     
80ml
滅活小牛血清                       
20ml
HT母×100                         
1ml
用5%NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4左右。

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