*抗體，Anti-streptomycin

【資料簡介】

 *抗體，Anti-streptomycin

從免疫血清純化抗體
1． 剪取一小條0.45 μm 的硝酸纖維膜，置于1.5ml eppendorf 管中，浸沒于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中，5 min。
2． 取出膜，置于濾紙上干燥。
3． 將膜放置于裝有1 ml Buffer A 的eppendorf 管，輕輕震蕩混勻30 min。
4． 移去Buffer A，用新鮮的Buffer A 洗一次，將膜浸沒于0.8-1 ml 相應(yīng)的抗血
清中，1-2 h, 于混勻器上輕輕震蕩混勻。
5． 移去血清，用PBS 洗膜，4 次，每次5 min。
6． 洗脫抗體
新配置100 mM *（pH 2.5）抗體洗脫液，將膜置于洗液中，手輕搖
混勻2 min，迅速將洗液轉(zhuǎn)移至裝有100 μl 1 M Tris（pH 8.0）中和，使抗體
復(fù)性。第1 次洗脫用400 μl 抗體洗脫液，第2，3 次用200 μl。
7． 往洗脫下來的液體中加入100 μl Buffer A 以穩(wěn)定抗體，并分裝成30 μl 每管，
于-20℃保存。
注：所有步驟均在室溫完成。

 

精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術(shù)，避免蛋白變性。如分離IgG時，多結(jié)合使 
用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應(yīng)用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。
一、鹽析法
取x ml血清加x ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀離心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此時，（NH4）2SO4的飽和度為33%]重復(fù)上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。
↓對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4+為止。
取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計測定蛋白含量。
影響鹽析的因素很多，如蛋白質(zhì)的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結(jié)果，操作時要充分注意（參閱本章 第二節(jié) ）。
二、冷酒精沉淀法
分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié) pH至7.7（±）冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下，加預(yù)冷的酒精（-20℃）到zui終濃度為20%，保持在-5℃。產(chǎn)生的沉淀（A），含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸調(diào)節(jié) pH到5.1，產(chǎn)生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液內(nèi)。調(diào)節(jié) 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到zui終濃度為25%，維持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同動物，IgG分離的條件和產(chǎn)量略有不同。見表2-5。從沉淀（B）可按下述方法進一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀（B）懸浮在0℃ 水中，調(diào)節(jié) pH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調(diào)節(jié) 上清液離子強度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui終濃度為10%，保持在–2℃或-3℃低溫，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
表2-5 從幾種動物和人血清沉淀A分離IgM的條件
物 種   pH   沉淀條件   IgG產(chǎn)量
    酒精濃度（%）   離子強度   
人   5.1   15.   0.01   65
山羊   5.2   0   0.01   65
家兔   5.2   10   0.01   70
大鼠   5.0   15   0.01   50
豚鼠   5.1   15   0.01   70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱層析純化免疫球蛋白
原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50）為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白（等電點為pH6.85～7.5），其余均屬酸性蛋白。PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG.
 *抗體，Anti-streptomycin （一）操作步驟
1．DEAE-Sephadex
A-50預(yù)處理 　稱DEAE-SephadexA-50（下稱A-50）5g，懸于500ml蒸餾水內(nèi)，1h后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作過程處理，zui后以0.5mol/LNaOH 再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過夜 。
2．裝柱
（1）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。
（2）將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2～3cm高時，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。
（3）關(guān)閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3．平衡 　　
啟開出水口螺旋夾，控制流速12～14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強度，兩者達到一致時關(guān)閉出水口，停止平衡。
4．加樣及洗脫   
啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（體積應(yīng)<床體積2%，蛋白濃度以<100mg為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內(nèi)，至與柱面相切時，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2～3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴/min。
5．收集 　
開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6．測蛋白 　　
以751型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm, 與OD260nm,按公式計算各管蛋白含量 。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。
7．合并、濃縮　 
將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG（MW6000）濃縮至所需體積，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存?zhèn)溆谩ｉL期保存時應(yīng)貯于-40℃冰箱。
8．A-50凝膠的再生　　 
在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達到再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存；近期不用時，以*洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。
（二）注意事項
（1）柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
（2）純化過程必須嚴(yán)格控制緩沖液的pH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后，才能進行柱層析。
（3）所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。
（4）洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，切勿過快。
（5）上樣的體積要小，濃度不宜過高。
（6）加樣及整個洗脫過程中，嚴(yán)防柱面變干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 親合層析純化 
IgG及IgG亞類
（一）原理
葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。改變pH及離子強度可洗脫結(jié)合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。
（二）操作步驟
用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠，（用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌）。
↓
裝柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡。標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質(zhì)，必要時用0.22μm濾膜過濾，上樣前用1mol/L pH9.0 Tris 液調(diào)整標(biāo)本液pH至8.1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^夜。
↓
加樣，一般按25～30mg IgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗液OD值為<0.02。
↓
用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用pH4.0；純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。
↓
用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。
↓
收集洗脫液測OD值，根據(jù)實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定。
（三）試劑器材
（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）
（2）磷酸緩沖液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
（3）枸櫞酸緩沖液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0   +0.02%   NaN30.1mol/LpH3.0 
（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5）再生緩沖液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸鈉含0.5mol/L NaCl調(diào)整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四）注意事項
（1）SPA-Sepharose CL-4B凝膠價格昂貴，可再生后反復(fù)使用10～20次左右。方法：先用10倍柱體積0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1mol/L pH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/L NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。
（2）SPA-Sepharose CL-4B親 合層析法還可用于：①除去抗體液中IgG,檢測非IgG抗體（如IgM）的生物學(xué)活性；②除去木瓜蛋白酶或*水解IgG后的Fc段；③吸收或純化免疫復(fù)合物。
（3）狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結(jié)合的能力。
五、和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體
從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親合層析等。應(yīng)用TSK DEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物學(xué)活性。
（一）原理
根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過增加洗 
脫液中的離子強度，洗脫并收集蛋白峰。
（二）操作步驟
腹水離心10000 g,10min，除去細(xì)胞和雜質(zhì)，在4℃下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40%飽和硫酸銨
↓攪拌20～30min
離心，沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對緩沖液A（pH8.5, 
20mmol/L Tris緩沖液）透析除鹽
↓4℃過夜
用帶有1000μl樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSK 
DEAE SPW離子交換層析柱
↓
洗脫流速1ml/min
0～1min ：0→5%緩沖液B（20nmol/L 
Tris, Ph 8.5,含2.0 
mol/L醋酸鈉）
1～2 min（ 線性梯度洗脫）：5→20%緩沖液B
20～22min：20→0%緩沖液B
↓
洗脫液用紫外280nm進行監(jiān)測
↓
收集蛋白峰，進行含量、純度和活性測定
（三）試劑和器材
（1）TSK 
DEAE SPW離子交換層析柱 （75mm×7.5mm,Bio 
Rad）
（2）液相色譜儀（包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測系統(tǒng)）
（3）PBS，緩沖液A和B。
（四）注意事項
（1）所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2μm濾膜過濾。
（2）在本實驗條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11-12min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb 
的存留時間（retention 
time）有所差異。
【附錄】
制備單克隆抗體常用的試劑
1．RPMT-1640培養(yǎng)液 其中含2mmol/L *，25 
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L 

RPMT-1640*培養(yǎng)液 上述溶液加10%～20%滅活小牛血清
3．HT母液×100
次黃嘌呤（H） 
1.0×10-2mol/L　　　　　　　　 
136.1mg
胸腺嘧淀核苷（T） 1.6×10-3mol/L 　　　　　　　38.8mg
蒸餾水 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100ml
4. A母液×100
氨基喋呤（A） 　　　　　　　　　　4×10-3mol/L 
1.76mg
蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 90.0ml
1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L 
HCl 0.5ml,再補加蒸餾水至100ml 。
5．HAT選擇培養(yǎng)液
RPMI-1640培養(yǎng)液 
　　　　　　　　　　　　　80ml
滅活小牛血清　　　　　　　　　　　　　　　 20ml
HT母液×100                       
1ml
A母液×100                       
1ml
用5%NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4左右。
6．HT培養(yǎng)液
RPMI-1640培養(yǎng)液                     
80ml
滅活小牛血清                       
20ml
HT母×100                         
1ml
用5%NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4左右。