915013-10-4紅橙熒光細胞骨架染色劑使用方法

【資料簡介】

Phalloidin-TRITC是一種紅橙熒光細胞骨架染色劑，它結合并標記F-actin（激發/發射最大值λ~540/565nm）。建議將小瓶內容物溶于1.5毫升甲醇或二甲基亞砜中，制成本品的儲備溶液。

產品名稱：羅丹明標記鬼筆環肽|TRITC Phalloidin
分子式：C60H70N12O13S2
分子量：1231.4
CAS：915013-10-4
結構式：
                                                                   運輸與保存方法：
冰袋運輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。
需要自備材料：

1） （可選）甲醇
2） 1×PBS 緩沖液, pH 7.4, 細胞培養級別
3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 緩沖液）
4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 緩沖液）
5） Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（不含 DAPI）DAPI
6） （可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含 DAPI）
7） （可選）BSA，標準級
8） 載玻片和蓋玻片
9） 蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）
10）組裝有 TRITC 激發/發射濾片，以及 DAPI 激發/發射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

西安凱新生物科技有限公司是國內業PEG供應商，可以提供不同分子量的PEG衍生物，小分子PEG的循環節可以做到1-36個，高分子PEG分子量從1000-40000不等，可以修飾的基團有：氨基類，NHBOC類，Fmoc類，羧酸類，Mal類，NHS類，疊氮類，DBCO類，Cy3/Cy5/Cy7類，THP類，芐基類，丙炔基類，溴代類，丙酸叔丁酯類，乙酸叔丁酯類，甲基類，磺酸酯類，巰基類，產品純度高達98%以上。

供應商：西安凱新生物科技有限公司

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操作步驟：

1.工作液準備
1）對于 TRITC 標記鬼筆環肽
本品以溶于甲醇的 20M 儲存液形式提供，總量為 300L。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 mL 的工 作液。建議收到產品后，根據單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩定。
開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現配現用。
2）對于 TRITC 標記鬼筆環肽
本品以凍干粉形式提供，分子量為 1231.4，總量為 1mg。可先用甲醇或者 DMSO 充分溶解配制成 20~100M 的儲存液。 如，加入 8.1208mL 甲醇到 1mg 鬼筆環肽即得到 100M 等量的儲存液，根據單次使用量，進行小量分裝，-20℃避光凍 存，一年穩定。
開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現配現用。
2.染色步驟
1）細胞爬片生長 24h，使其密度達到 50%匯合度。
2）吸掉培養液，37℃預熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細胞 2 次。
3）使用溶于 PBS 的 4%進行細胞固定，室溫固定 10min。
注：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。
4）室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10min。
5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5min。
6）室溫條件下，用 PBS 清洗細胞 2~3 次，每次 10min。
7）取 200l 配制好的 TRITC 標記鬼筆環肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育 30min（通常情況下，4℃~37℃ 孵育皆可）。
注：為了降低背景，可于 TRITC 標記的鬼筆環肽工作液內加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發，可 將蓋玻片轉移到一個密封的容器內。
8）用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5min。
9）使用 200l DAPI 溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約 30s。
10）用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封 片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個月內可繼續做 F-actin 染色分析。
注：也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑合并步驟 9）10），簡化步驟。
11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇 TRITC 激發/發射濾片（Ex/Em=545/570nm）和 DAPI 激發/發射濾 片（Ex/Em=364/454nm）。
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