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致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒
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關 鍵 詞 | 致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒 |
- 【資料簡介】
產品名稱:致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒產品規格:50T/盒
產品貨號:KLP08-A0231
產品簡介:
大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的病原菌,常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道集聚 性 大 腸 埃 希 氏 菌( enteroaggregative Escherichia coli, EAEC )、 腸 道 致 病 性 大 腸 埃 希 氏 菌(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)、產志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC) (包括腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC))、產腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)。該菌廣泛存在于自然界,當其污染食品或水源后,可引起細菌性食物中毒或水源性腹瀉病爆發流行,所以致瀉大腸埃希氏菌的檢測對社會衛生健康具有極大的意義。
為了滿足致瀉大腸埃希氏菌檢測及研究的需要,本公司根據標準 GB4789. 6 合成了致瀉大腸埃希氏菌特征性基因特異性引物,并優化形成本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、操作簡單等特點及優點。
包裝規格及成分:
編號
成分
規格
試劑一
致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液
1 mL×1 管
試劑二
陽性對照
200 µL×1 管
試劑三
陰性對照
200 µL×1 管
使用說明書
1 份
運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存。操作步驟:
一、樣本制備(參考 GB4789. 6)
固態或半固態樣品:固體或半固態樣品,以無菌操作稱取檢樣 25 g,加入裝有 225 mL 營養肉湯的均質杯中,用旋轉刀片式均質器以 8000 r/min~10000 r/min 均質 1 min~2 min,或加入裝有 225 mL 營養肉湯的均質袋中,用拍擊式均質器均質 1 min~2
min 。
液態樣品:以無菌操作量取檢樣 25 mL,加入裝有 225 mL 營養肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠),振蕩混勻。
二、增菌
將 1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養 6 h,取 10 μL ,接種于 30 mL 腸道菌增菌肉湯管內,于 42℃±1℃培養 18 h 。
三、分離
將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培養 18 h~24 h ,觀察菌落特征。在 MAC 瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色;在 EMB 瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色,應挑取乳糖發酵,以及乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。
四、PCR 模板制備
- DNA 提取:使用 1 μL 接種環刮取營養瓊脂平板或斜面上培養 18 h~24 h 的菌落懸浮在 200 μL 0. 85%滅菌生理鹽水中,充分打散制成菌懸液,于 13000r / min 離心 3min,棄掉上清液。加入 1 mL 滅菌去離子水充分混勻菌體,于 100℃水浴或者金屬浴維持 10 min;冰浴冷卻后 13000 r / min 離心 3 min,收集上清液;按 1∶ 20 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液,取 5 μL 作為 PCR 檢測的模板;可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA,操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。
- DNA 保存:所有處理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反應或暫存于 4 ℃ 并當天進行PCR 反應;否則,應在-20 ℃ 以下保存備用 1 周。也可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA,操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。
五、試劑準備
- 擴增試劑準備(在反應混合液配制區進行):從試劑盒中取出 PCR 反應液,解凍混勻,瞬離后向每個 PCR 管中各分裝 20 μL PCR 反應液,轉移至樣本處理區。
- 加樣(在樣本處理區進行):在 PCR 反應管內加入 5 μL 制備的核酸樣本陽性對照或陰性對照,蓋上蓋子,輕彈混勻并瞬時離心后,立即轉移至檢測區進行反應。總反應體系如下表。
試劑
添加量(25 μL)
致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液
20 μL
DNA 樣品/陽性對照/陰性對照
5 μL
六、PCR 檢測(在檢測區進行) 請按照下表設置反應程序:
階段
溫度設計
循環數
預變性
98℃
30
sec
1 ×
PCR 反 應
98℃
15
sec
30 ×
55℃
30
sec
68℃
10
sec
反應結束后,將產物進行 1.8%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結束后分析其條帶情況。
【結果判定方法】結果判定
1) 陰性對照:無目的基因條帶
2) 陽性對照:有目的基因 Stx1(244 bp)和 sth(171 bp)的明顯條帶。
致瀉大腸埃希氏菌類別
陽性基因名稱
片段長度(bp)
腸道聚集性大腸埃希氏菌(EAEC)
astA
102
腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)
escV
544
產志賀毒素大腸埃希氏菌/腸道出血性大腸埃希
氏菌
(STEC / EHEC)
Stx1, escV+ Stx1
244 / 544+244
產腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)
sth
647
腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)
ipaH
171
注意事項
1. 開始檢測前請仔細閱讀本說明書,按要求操作。
2. 組織樣品的樣本處理和核酸擴增應注意生物安全
3. 試劑使用前,應充分融化均勻后,瞬時離心;PCR 反應管避免反復凍融。
4. 加樣時應使樣品落入反應液中,不應有樣品黏附于管壁上,加樣后應盡快壓緊管蓋。
5. 經樣品前處理液處理過的樣本,不能用于樣本保存,僅用于即時檢測
6. 研磨組織樣本不宜過大,以防雜質含量高而抑制后續的 PCR 反應。
7. 樣品前處理液可置于 4℃保存。
8. 本產品只能用于科研實驗,不能用于臨床診斷。
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