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致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒

2020年12月25日 10:17:36人氣:94來源:上海卡努生物科技有限公司

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關 鍵 詞致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒
【資料簡介】

產品名稱:致瀉性大腸埃希氏菌五重 PCR 試劑盒產品規格:50T/盒

產品貨號:KLP08-A0231

 

產品簡介:

大腸埃希氏菌是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的病原菌,常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道集聚                enteroaggregative Escherichia coli, EAEC                       enteropathogenic Escherichia coliEPEC、產志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga  toxin-producing  Escherichia  coli,  STEC) (包括腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic  Escherichia  coliEHEC)、產腸毒素大腸埃希氏菌enterotoxigenic  Escherichia  coliETEC、腸道侵襲性大腸埃希氏菌enteroinvasive  Escherichia  coli,  EIEC。該菌廣泛存在于自然界,當其污染食品或水源后,可引起細菌性食物中毒或水源性腹瀉病爆發流行,所以致瀉大腸埃希氏菌的檢測對社會衛生健康具有極大的意義。

為了滿足致瀉大腸埃希氏菌檢測及研究的需要,本公司根據標準  GB4789.  6  合成了致瀉大腸埃希氏菌特征性基因特異性引物,并優化形成本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、操作簡單等特點及優點。

 

包裝規格及成分:

 

編號

成分

規格

試劑一

致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液

1 mL×1 管

試劑二

陽性對照

200 µL×1 管

試劑三

陰性對照

200 µL×1 管

使用說明書

1  份

 

運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存。操作步驟:

一、樣本制備(參考  GB4789.  6

固態或半固態樣品:固體或半固態樣品,以無菌操作稱取檢樣 25 g,加入裝有 225 mL  營養肉湯的均質杯中,用旋轉刀片式均質器以   8000  r/min~10000  r/min  均質 1 min~2  min,或加入裝有  225  mL  營養肉湯的均質袋中,用拍擊式均質器均質  1  min~2

 

min  

液態樣品:以無菌操作量取檢樣 25 mL,加入裝有 225  mL  營養肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠),振蕩混勻。

二、增菌

將 1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養 6 h,取 10 μL ,接種于 30 mL 腸道菌增菌肉湯管內,于 42℃±1℃培養 18 h 。

三、分離

將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培養 18 h~24 h ,觀察菌落特征。在  MAC   瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色;在 EMB 瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色,應挑取乳糖發酵,以及乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。

四、PCR  模板制備

  • DNA 提取:使用 1 μL 接種環刮取營養瓊脂平板或斜面上培養 18 h~24 h 的菌落懸浮在 200  μL  0.  85%滅菌生理鹽水中,充分打散制成菌懸液,于  13000r  /  min  離心  3min,棄掉上清液。加入 1 mL  滅菌去離子水充分混勻菌體,于 100℃水浴或者金屬浴維持 10  min;冰浴冷卻后 13000  r  /  min  離心 3  min,收集上清液;按  120 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液,取 5 μL 作為 PCR 檢測的模板;可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA,操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。
  • DNA 保存:所有處理后的 DNA 模板直接用于 PCR 反應或暫存于 4 ℃  并當天進行PCR  反應;否則,應在-20  ℃  以下保存備用 1 周。也可用細菌基因組提取試劑盒提取細菌 DNA,操作方法按照細菌基因組提取試劑盒說明書進行。

五、試劑準備

  • 擴增試劑準備(在反應混合液配制區進行):從試劑盒中取出 PCR 反應液,解凍混勻,瞬離后向每個 PCR 管中各分裝 20 μL PCR 反應液,轉移至樣本處理區。
  • 加樣(在樣本處理區進行):在 PCR 反應管內加入 5 μL 制備的核酸樣本陽性對照或陰性對照,蓋上蓋子,輕彈混勻并瞬時離心后,立即轉移至檢測區進行反應。總反應體系如下表。

試劑

添加量(25 μL)

致瀉大腸埃希氏菌五重 PCR 反應液

20  μL

DNA 樣品/陽性對照/陰性對照

5  μL

 

六、PCR 檢測(在檢測區進行) 請按照下表設置反應程序:

階段

溫度設計

循環數

預變性

98℃

30

sec

1  ×

 

PCR 反 應

98℃

15

sec

 

30  ×

55℃

30

sec

68℃

10

sec

反應結束后,將產物進行  1.8%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結束后分析其條帶情況。

 

【結果判定方法】結果判定

1) 陰性對照:無目的基因條帶

2) 陽性對照:有目的基因 Stx1(244 bp)sth(171 bp)的明顯條帶。

致瀉大腸埃希氏菌類別

陽性基因名稱

片段長度(bp)

腸道聚集性大腸埃希氏菌(EAEC)

astA

102

腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)

escV

544

產志賀毒素大腸埃希氏菌/腸道出血性大腸埃希

氏菌

(STEC / EHEC)

Stx1, escV+ Stx1

244 / 544+244

產腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)

sth

647

腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)

ipaH

171

 

注意事項

1. 開始檢測前請仔細閱讀本說明書,按要求操作。

2. 組織樣品的樣本處理和核酸擴增應注意生物安全

3. 試劑使用前,應充分融化均勻后,瞬時離心;PCR 反應管避免反復凍融。

4. 加樣時應使樣品落入反應液中,不應有樣品黏附于管壁上,加樣后應盡快壓緊管蓋。

5. 經樣品前處理液處理過的樣本,不能用于樣本保存,僅用于即時檢測

6. 研磨組織樣本不宜過大,以防雜質含量高而抑制后續的 PCR 反應。

7. 樣品前處理液可置于 4℃保存。

8. 本產品只能用于科研實驗,不能用于臨床診斷。

上海卡努生物科技有限公司作者

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