β-木糖苷酶（β- xylosidase）測定試劑盒

【資料簡介】

測定意義：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關鍵酶，產物木糖可作為碳源應用于微生物發(fā)酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應用價值。

測定原理：

β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產生對硝基苯酚，對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，測定405nm光吸收增加速率，可計算β-木糖苷酶活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 植物樣本：稱取約0.1g樣品，加1mL提取液充分冰浴勻漿，然后12000rpm，4℃，離心20min，棄沉淀 ，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清作為待測酶液。
2. 細菌、真菌樣本：收集約500萬個細胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，棄沉淀 ，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清置于冰上待測。

測定操作表：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至405nm，對照管調零。
2. 操作表

	對照管	測定管
酶液（μL）	40	40
試劑一（μL）		10
試劑二（μL）	80	70
混勻，45℃水浴20min
試劑三（μL）	80	80
混勻，靜置5min，對照管調零， 微量石英比色皿/96孔板，測定405nm吸光值，記為A405。

β-木糖苷酶活性計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y=3.34x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量計算

酶活定義：45℃，pH7.4時，每毫克蛋白質1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每克樣品1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鮮重）= （A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按細胞數(shù)量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每10⁴個細胞1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴ cell）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細胞數(shù)量

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷細胞數(shù)量

ε：對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，138mol/L/cm；d：比色皿光徑，1cm；T：反應時間，20 min；稀釋倍數(shù)：V反總÷V樣=5；1000：1000mL=1L；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=1.67x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量計算

酶活定義：45℃，pH7.4時，每毫克蛋白質1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每克樣品1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鮮重）= （A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按細胞數(shù)量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每10⁴個細胞1min內催化產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴cell）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細胞數(shù)量

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷細胞數(shù)量

ε：對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，138mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；T：反應時間，20 min；稀釋倍數(shù)：V反總÷V樣=5；1000：1000mL=1L；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、吸光度變化應該控制在0.05~0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應改變。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定，可選用考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒進行測定。