分子信標技術

【資料簡介】

 

1、前言

在基因時代和蛋白質時代，人們迫切需要一種具有高靈敏度和高親和力的生物分子探針，用以進行定性和定量檢測。1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信標技術，很快這種技術就廣泛的應用于醫學、生物學、分子生物學、臨床醫學和化學等諸多領域。分子信標技術具有*的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進行實時定量檢測、甚至可以用于活體分析。在臨床診斷、基因檢測等領域，分子信標也越來越顯示出它的優勢。近年來，人們對分子信標的結構作了諸多改進，發展出很多具有更多特性的新型分子信標。隨著分子信標的發展，該技術也必將在更多領域中發揮出它的優勢。

分子信標技術是一種基于熒光共振能量轉移現象（FRET）和堿基互補配對原則建立起來的一種分析技術。分子信標作為一種熒光標記的分子探針，具有*的特異性和較高的靈敏度，目前已經成為基礎醫學和生物學的重要研究工具。本文著重介紹了分子信標的基本原理及其應用，并對其近年來的研究進展做以簡單介紹。

2、分子信標的原理

分子信標是一種熒光標記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個核苷酸。在結構上，分子信標大體上可以分為三部分：（1）、環狀區：一般由15～30個核苷酸組成，可以與靶分子特異結合；（2）、莖干區：一般由5～8個堿基對組成，在分子信標與靶分子結合過程中可發生可逆性解離。（3）、熒光基團和淬滅基團：熒光基團一般連接在5ˊ端；淬滅基團一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團。根據Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團與淬滅基團之間達到一定的距離時才會產生熒光。

自由狀態時，分子信標呈發卡式結構，從而熒光基團和淬滅基團相距較近（約7～10nm）。此時發生熒光共振能量轉移，使熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收并以熱的形式散發，熒光幾乎*被淬滅，熒光本底極低。當分子信標與靶分子結合時，熒光基團和淬滅基團之間的距離加大，從而，分子信標的熒光幾乎100%恢復。而且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標量成正比。

 

3、影響分子信標的主要因素

分子信標中，熒光基團和淬滅基團之間的距離是影響分子信標的zui主要因素。根據Foerster理論，熒光基團與淬滅基團之間的距離直接影響熒光的強度。

另外，溫度也是影響分子信標的一個重要因素。在較低溫度下，分子信標才可以保持發卡結構。在較高溫度下，分子信標將無法保持其發卡結構，甚至使其伸展為隨機線狀，造成熒光基團和淬滅基團分離，從而發出熒光，出現假陽性結果。有文獻表明，其熔鏈溫度取決于莖干區的長度、G-C含量和緩沖液的離子強度。

Bonnet等研究溫度對分子信標影響時發現，體系的熒光強度呈現為一個先減弱后增強的過程。就此，Bonnet等做出如下解釋：

 

在較低溫度下，分子信標與靶標結合呈S1狀態，發出熒光。隨著溫度升高，分子信標與靶標分離，分子信標重新恢復為發卡式結構即S2狀態，從而熒光強度減弱。溫度持續增高，將導致分子信標熔鏈即S3狀態，熒光基團與淬滅基團分離，導致熒光恢復。

環境pH值也是影響分子信標的一個因素。pH值過高，分子信標的發卡結構可能被破壞，出現假陽性結果。此外，分子信標的純度，也將對分子信標產生影響。

4、在基礎醫學中的應用

zui初被用作PCR的熒光探針，它既可以對擴增產物進行定量檢測，又可以對擴增過程進行實時的檢測。近年來，隨著的發展和成熟，人們不斷開拓其應用領域，目前，分子信標不僅可以用于基因的定量、定性檢測，還可以用于基因點突變等的分析，將分子信標與PNA-DNA-環技術結合，使檢測雙鏈DNA成為可能。另外，還為研究DNA-蛋白質之間的相互作用提供了一種簡單、直接、靈敏、實時、甚至可以用于活體檢測的方法。利用在分析、檢測核酸和蛋白質中的優點，還可以作為生物芯片和生物傳感器的探針。總之，已經廣泛的應用在基礎醫學研究中的眾多領域。

4.1 實時定量PCR測定靶標濃度

在其出現之初就被用于實時定量PCR測定靶標濃度。這一技術是基于熒光信號積累實時檢測整個PCR進程。它是在常規的PCR的基礎上加入相應的分子信標，在PCR的每一循環過程中，都會發生分子信標與擴增產物結合，從而產生熒光，但這并不影響PCR的整個過程。并且只有能和分子信標結合的DNA模板得到擴增時才能產生熒光信號。所以熒光強度與特異性擴增產物的量成正比，它是模板被PCR擴增的直接標志。與常規的核酸檢測方法相比，分子信標可以進行閉管操作，有效消除核酸的交叉污染，具有實時、定量、高靈敏度、高特異性等特點。

4.2 用于活體內核酸的動態檢測

通過將分子信標注入活細胞內，使分子信標與特定的模板結合產生熒光。可以通過熒光顯微鏡實時、動態的檢測整個過程。如可以用于細胞內mRNA的動態檢測，以了解其在轉錄等過程中的變化。但活體內存在大量的酶，其中某些酶可能導致分子信標水解，使其結構破壞產生熒光，出現假陽性結果。PNA分子信標可以很好的解決這一問題，PNA分子信標可以有效的避免核酶的水解，使熒光強度能準確反映活體內的過程。

4.3 用于雙鏈DNA的檢測

與RNA不同，DNA是雙螺旋結構，常規方法難以進行檢測。而可用于雙鏈DNA分子的檢測。PNA與雙鏈DNA互補鏈結合時可以取代非互補鏈，使其解離成單鏈，形成P環結構。解離后的DNA雙鏈及可用檢測，使分子信標與DNA變性部分結合，從而出現熒光。

4.4 用于蛋白質的檢測

隨著基因組學的發展，出現了蛋白質組學，人們越來越發現許多問題要到蛋白質中去尋找答案。這就要求人們能夠對蛋白質各方面的性質可以加以檢測。此外，人們把蛋白質和核酸起來，研究蛋白質和核酸之間的相互作用，這一課題已成為現代分子生物學的研究熱點之一。與傳統的蛋白質研究方法（如X單晶衍射、圓二色譜等技術）相比，具有簡單、靈敏的特點，又可以實現實時檢測，甚至可以用于活體檢測。

2001年，Tan等發表文章闡述了其應用研究蛋白質所取得的結果。他們用分子信標來檢測單鏈結合蛋白，實驗發現，分子信標產生的熒光。所產生的熒光強度較分子信標與核酸結合時產生的熒光強度小，但其強度遠遠大于分子信標與核酸發生錯配時產生的熒光強度。同時他們還發現分子信標不能與雙鏈結合蛋白結合，產生熒光。

Nobuko Hamaguchi根據分子信標的原理設計了Aptamer信標，可以直接用來檢測蛋白質。這一方法與傳統的酶聯免疫吸附法測定蛋白質相比，具有簡單、靈敏等優點。但這一方法不能用于檢測非特異性ssDNA結合蛋白，而且分子信標的構象受金屬離子影響很大，一些金屬離子的存在會干擾熒光信號的觀測。

4.5 用于基因的檢測

在基因時代，基因的檢測方法也取得了飛速發展。近年來，國內外很多科學家嘗試用來檢測基因，并取得了初步的成果。人們將與毛細管電泳技術相結合，初步實現了基因檢測的自動化或半自動化，使大面積、高通量篩選成為可能。

5、在臨床醫學中的應用

5.1 在癌癥診斷中的應用

2001年賓夕法尼亞大學的B.Chance 教授在美國物理學會上宣布，他和同事合作制得了可以用于癌癥診斷的分子信標，并在老鼠體內取得了初步的成功，已準備做臨床實驗。

他們首先將分子信標注射到體內，當它與乳腺癌有關的生化酶發生作用時才會打開，否則就保持密封狀態。信標打開后就會在體外裝置中的光束在近紅外處發生熒光響應，從而探測到信標的信號，由于信標能發射大量的近紅外光，所以它可以通過人體。這種方法沒有離子輻射且價格便宜，其成本約為幾千美元。這種裝置的另一個優點是它的工藝及實施以常用的光盤和單元為基礎的，從而簡便、易行。

5.2 用于SARS的診斷

2003年SARS病毒在中國內地的出現以及在部分國家的肆意和傳播，給人類健康提出了嚴峻的挑戰。許多國家的科研人員都在開發快速和檢測SARS病毒的方法和技術，諸如RT-PCR、ELISA、免疫熒光法等，并已經在推出相應的檢測試劑盒。但是，目前這些檢測仍然需要結合臨床體征的判斷，這主要是由于這幾種方法還存在著一些自身缺陷，比如RT-PCR對SARS檢測的靈敏性還不令人滿意，即有出現假陰性的傾向，曾報道有出現漏檢的情況發生；使用免疫熒光法和ELISA法的SARS抗體檢測也存在敏感性問題；其中免疫熒光法又只能在病人感染病毒10天以后才能檢測出抗體，而ELISA則要在20天以后才能檢測出抗體。

的基本原理應用的是堿基互補配對原則，這就有效的保證了用此技術檢測SARS病毒的特異性。此外作為基因水平的檢測其靈敏性也較上述方法高。于上述方法需要再感染幾天后才能檢出相比，只要體內有SARS病毒的核酸出現即可被檢出，從而為臨床治療贏得寶貴的時間，具有較大的臨床應用價值。

5.3 用于乙肝病毒的檢測

Yates等2001年在臨床微生物學雜志發表文章，提出了用檢測乙肝病毒的方法。該方法定量檢測HBV DNA，具有簡便、易行、可靠等優點，有很好的應用前景。目前，國外已有成型的試劑盒出售，國內也有類似產品。

6、前景與展望

自其誕生以來，由于它*的特異性、靈敏度等特點迅速進入生物學、基礎醫學、臨床醫學等各個相關領域。人們對分子信標的結構也進行了數次改進和發展，使之可以在更廣的范圍內發揮更大的作用。以為基礎人們開發出可進行高通量篩選的芯片。如果該技術與納米技術、激光共聚焦技術等其他*技術相結合，也必然會促進的發展。毫無疑問的是有著廣闊的應用空間。隨著制備技術的發展，設計方法的改進必將更加完善。

7、參考文獻

[1] S Tyagi, F R Kramer Nat Biotechnol, 1996，14: 303～308

[2] Ota N, Hirano K, Warashina M, et al, Nucleic Acids Res, 1998, 26（3）: 735～743

[3] Sokol D, Zhang X L, Lu P et al, Proc Natl.Acid Sci.US, 1998, 95: 11538～11543

[4] Bukanov N O, Denidov V V, Nielsen P E et al, Proc Natl.Acid Sci.US, 1998, 95: 5516～5520

[5] Yates S, Penning M, Goudsmit J, et al, J Clin Microbiol, 2001, 39:3656～3665

[6] 周海清 沈鶴柏等 光譜實驗室 2004，V21 417～422

[7] 陳忠斌 王升啟 孫志賢 生物化學與生物物理學進展 1998，25 488～492

[8] 王怡瑾 王宏等 化學通報 2004 12 912～918

[9] 姜曉峰 王雅杰 張琨 中國實驗診斷學 2003 7（3）185～189

原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/j820571379 （滬宇生物）