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免疫組織化學(xué)細(xì)胞的組織浸蠟和切片
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- 【資料簡介】
組織經(jīng)過脫水、透明后置人石蠟中,使組織變硬而利于切片的過程稱為浸蠟。
為了使石蠟*取代組織中的透明劑,必須經(jīng)3次浸蠟,每次時間為1h左右。本實驗 室蠟的熔點一般為56~58~C,這種熔點的蠟較適中,經(jīng)過此種石蠟浸透,包埋后切片順利,連續(xù)性好,展片平整。
切片是免疫組化準(zhǔn)備工作的zui后一步,其切片質(zhì)量相對于常規(guī)組織切片來說要求更高,要切得薄而平整,并注意不可有刀痕。主要有石蠟切片、冰凍切片、塑料包埋切片、碳蠟切片等。在切片前還需對載玻片進(jìn)行相應(yīng)的處理。
一、載玻片的處理
免疫組化染色時間長,特別是雙PAP、免疫金銀染色等方法,所需時間更長,并要反復(fù)洗滌,切片在試劑中長時間浸泡,經(jīng)多次洗滌,極易造成脫片而影響實驗的結(jié)果。需采用以下方法處理:載玻片先置于洗潔液(或洗衣粉溶液)中煮沸30min,清水洗干凈后放人清潔液中浸泡12—24h,漂洗,用蒸餾水清洗后置于烤箱內(nèi)干燥,然后涂以切片黏合劑。
切片黏合劑的配制方法如下。
(1)明礬—明膠的配制方法 明礬、明膠各1g,加入到100ml 1%甘油中,加熱至70~C熔化,并攪拌混合至*透明狀,將切片浸入此液中幾分鐘,也可以涂在載玻片上,36℃2h后即可使用。
(2)合成乳膠—聚醋酸乙烯乳液的配制方法 合成乳膠是一種高分子乳化聚合物,具有高度黏合力,無毒、無臭、無腐蝕性。取合成乳膠10份,加蒸餾水90份,攪拌成10%的使用液備用。載玻片可以浸泡此液中,也可以涂片。浸泡時濃度稀一點;用于涂片濃度高一點,涂完后在36~C中5h后即可使用。
(3)多聚賴氨酸 0.05%多聚賴氨酸(分子質(zhì)量200kDa)水溶液,臨用時現(xiàn)配,電吹風(fēng)吹干即可使用。
(4)進(jìn)口切片黏合劑 此膠屬樹脂膠,國外作為木材的黏合劑。涂膠方法同(1),即直接涂片或浸入涂片。一般買回來的黏合劑需10%稀釋。
(5)甲醛—明膠 1%明膠5mi,2%甲醛5ml,混合即可涂片。
(6)明膠—鉻明礬—戊二醛黏合劑 載玻片在10%Extron中65℃清洗60min,用熱水沖洗60min,雙重蒸餾水洗2次,空氣干燥,然后浸在0.5%明膠—0.05%鉻明礬液(注:先將0.5%明膠60~C溶解,冷卻后加入鉻明礬)中,40~C浸浴lmin,空氣干燥,用0。2%戊二醛(PBS配制)固定60min,PBS洗后,切片空氣干燥,于4~C保存。
(7)白膠—多聚賴氨酸混合液—取進(jìn)口切片黏合劑10ml,加10mg多聚賴氨酸混勻,即可用于涂片。
二、石蠟切片
石蠟切片不僅是常規(guī)病理中的重要切片形式,也是免疫組化研究中較常用的切片形式,它能滿足免疫組化的連續(xù)切片要求。為了便于染色及觀察,切片時應(yīng)注意:①連續(xù)切片時應(yīng)按順序分離及貼片,不應(yīng)顛倒;②貼片時應(yīng)距載玻片一端至少1cm,一般靠一邊,以利于顯色安全;③用于免疫組織化學(xué)染色的蠟溫應(yīng)為56—58℃,切片水溫在40℃左右,應(yīng)先置于冷水中,然后再移人熱水中,這樣可以使切片能順利展平;④切片刀要求快,切片要薄,無刀痕和皺褶,在染色時可減少非特異染色;⑤烤片時要注意,抗原性較強(qiáng)的組織可在60℃烤3—8h,抗原較弱的組織可于37℃恒溫箱內(nèi)過夜;⑥切片如需長期保存,可置于4℃或室溫下,千萬不可脫蠟后4℃保存,因脫蠟后失去了對抗原決定簇的保護(hù)。
三、冰凍切片
冰凍切片的優(yōu)點是能較完整地保存抗原性。組織細(xì)胞的某些抗原成分,特別是細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及肽類抗原在石蠟切片的處理過程中,可不同程度遭受破壞或失去抗原性,而冰凍切片就能zui大限度地保護(hù)抗原。缺點是在冷凍過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)可能破壞,抗原易彌散,不能用于常規(guī)病檢及回顧性研究。
目前大多采用恒冷箱冰凍切片機(jī),將新鮮組織置于-25℃左右的恒冷箱中,待組織*冷凍后即可連續(xù)切片。其注意事項:①切片刀要快,并且預(yù)先冷凍,恒冷箱的溫度一般調(diào)至-25℃左右,不能太低,否則組織表面易出現(xiàn)冰渣;②抗卷板的位置要適中,否則難成片;③貼片時動作輕而迅速,否則易出現(xiàn)皺褶;④組織從液氮內(nèi)或-80℃取出,必須進(jìn)行溫度平衡后才能切成片,切完的組織如下次還用,應(yīng)用冷凍頭在沒有*溶解前取下,密閉后低溫保存。
切片后,應(yīng)用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干或自然干燥。如在短時間內(nèi)用,可全部進(jìn)行固定,固定后,PBS洗,吹干后低溫冰箱內(nèi)保存。
四、碳蠟切片http://www.kindlingtouch.com/Login/default?Stand_DownLoadOperate
碳蠟切片與石蠟切片相似,碳蠟是水溶性蠟,因此切片時不需用水展片,只需貼在載玻片上,吹干即可。切好片應(yīng)把碳蠟塊密閉保存在干燥器內(nèi)。另外,碳蠟切片不需脫蠟至水,切片可直接入水進(jìn)行各種染色。
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