免疫組織化學(xué)細(xì)胞的組織浸蠟和切片

【資料簡介】

組織經(jīng)過脫水、透明后置人石蠟中，使組織變硬而利于切片的過程稱為浸蠟。
為了使石蠟*取代組織中的透明劑，必須經(jīng)3次浸蠟，每次時間為1h左右。本實驗  室蠟的熔點一般為56～58~C，這種熔點的蠟較適中，經(jīng)過此種石蠟浸透，包埋后切片順利，連續(xù)性好，展片平整。
切片是免疫組化準(zhǔn)備工作的zui后一步，其切片質(zhì)量相對于常規(guī)組織切片來說要求更高，要切得薄而平整，并注意不可有刀痕。主要有石蠟切片、冰凍切片、塑料包埋切片、碳蠟切片等。在切片前還需對載玻片進(jìn)行相應(yīng)的處理。
一、載玻片的處理
免疫組化染色時間長，特別是雙PAP、免疫金銀染色等方法，所需時間更長，并要反復(fù)洗滌，切片在試劑中長時間浸泡，經(jīng)多次洗滌，極易造成脫片而影響實驗的結(jié)果。需采用以下方法處理：載玻片先置于洗潔液（或洗衣粉溶液）中煮沸30min，清水洗干凈后放人清潔液中浸泡12—24h，漂洗，用蒸餾水清洗后置于烤箱內(nèi)干燥，然后涂以切片黏合劑。
切片黏合劑的配制方法如下。
（1）明礬—明膠的配制方法  明礬、明膠各1g，加入到100ml 1％甘油中，加熱至70~C熔化，并攪拌混合至*透明狀，將切片浸入此液中幾分鐘，也可以涂在載玻片上，36℃2h后即可使用。
（2）合成乳膠—聚醋酸乙烯乳液的配制方法  合成乳膠是一種高分子乳化聚合物，具有高度黏合力，無毒、無臭、無腐蝕性。取合成乳膠10份，加蒸餾水90份，攪拌成10％的使用液備用。載玻片可以浸泡此液中，也可以涂片。浸泡時濃度稀一點；用于涂片濃度高一點，涂完后在36~C中5h后即可使用。
（3）多聚賴氨酸  0．05％多聚賴氨酸（分子質(zhì)量200kDa）水溶液，臨用時現(xiàn)配，電吹風(fēng)吹干即可使用。
（4）進(jìn)口切片黏合劑  此膠屬樹脂膠，國外作為木材的黏合劑。涂膠方法同（1），即直接涂片或浸入涂片。一般買回來的黏合劑需10％稀釋。
（5）甲醛—明膠  1％明膠5mi，2％甲醛5ml，混合即可涂片。
（6）明膠—鉻明礬—戊二醛黏合劑  載玻片在10％Extron中65℃清洗60min，用熱水沖洗60min，雙重蒸餾水洗2次，空氣干燥，然后浸在0．5％明膠—0．05％鉻明礬液（注：先將0．5％明膠60~C溶解，冷卻后加入鉻明礬）中，40~C浸浴lmin，空氣干燥，用0。2％戊二醛（PBS配制）固定60min，PBS洗后，切片空氣干燥，于4~C保存。
（7）白膠—多聚賴氨酸混合液—取進(jìn)口切片黏合劑10ml，加10mg多聚賴氨酸混勻，即可用于涂片。
二、石蠟切片
石蠟切片不僅是常規(guī)病理中的重要切片形式，也是免疫組化研究中較常用的切片形式，它能滿足免疫組化的連續(xù)切片要求。為了便于染色及觀察，切片時應(yīng)注意：①連續(xù)切片時應(yīng)按順序分離及貼片，不應(yīng)顛倒；②貼片時應(yīng)距載玻片一端至少1cm，一般靠一邊，以利于顯色安全；③用于免疫組織化學(xué)染色的蠟溫應(yīng)為56—58℃，切片水溫在40℃左右，應(yīng)先置于冷水中，然后再移人熱水中，這樣可以使切片能順利展平；④切片刀要求快，切片要薄，無刀痕和皺褶，在染色時可減少非特異染色；⑤烤片時要注意，抗原性較強(qiáng)的組織可在60℃烤3—8h，抗原較弱的組織可于37℃恒溫箱內(nèi)過夜；⑥切片如需長期保存，可置于4℃或室溫下，千萬不可脫蠟后4℃保存，因脫蠟后失去了對抗原決定簇的保護(hù)。
三、冰凍切片
冰凍切片的優(yōu)點是能較完整地保存抗原性。組織細(xì)胞的某些抗原成分，特別是細(xì)胞膜抗原、受體抗原、酶及肽類抗原在石蠟切片的處理過程中，可不同程度遭受破壞或失去抗原性，而冰凍切片就能zui大限度地保護(hù)抗原。缺點是在冷凍過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)可能破壞，抗原易彌散，不能用于常規(guī)病檢及回顧性研究。
目前大多采用恒冷箱冰凍切片機(jī)，將新鮮組織置于-25℃左右的恒冷箱中，待組織*冷凍后即可連續(xù)切片。其注意事項：①切片刀要快，并且預(yù)先冷凍，恒冷箱的溫度一般調(diào)至-25℃左右，不能太低，否則組織表面易出現(xiàn)冰渣；②抗卷板的位置要適中，否則難成片；③貼片時動作輕而迅速，否則易出現(xiàn)皺褶；④組織從液氮內(nèi)或-80℃取出，必須進(jìn)行溫度平衡后才能切成片，切完的組織如下次還用，應(yīng)用冷凍頭在沒有*溶解前取下，密閉后低溫保存。
切片后，應(yīng)用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干或自然干燥。如在短時間內(nèi)用，可全部進(jìn)行固定，固定后，PBS洗，吹干后低溫冰箱內(nèi)保存。
四、碳蠟切片http://www.kindlingtouch.com/Login/default?Stand_DownLoadOperate
碳蠟切片與石蠟切片相似，碳蠟是水溶性蠟，因此切片時不需用水展片，只需貼在載玻片上，吹干即可。切好片應(yīng)把碳蠟塊密閉保存在干燥器內(nèi)。另外，碳蠟切片不需脫蠟至水，切片可直接入水進(jìn)行各種染色。