（2）CaCl₂濃度細胞活性的影響

在海藻酸鈉包埋固定化過程中，凝膠化劑CaCl₂中的Ca²⁺于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定。CaCl₂溶液的濃度對固定化細胞顆粒機械強度的影響見表四。

 

表四 CaCl₂濃度對固定化細胞凝膠機械強度的影響

 

隨著CaCl₂濃度的增加，微生物細胞的活性降低。當CaCl₂濃度低于5%時，細胞活性可以保持在80%以上；但是當CaCl₂濃度達到10%，細胞活性下降到60%左右，主要原因估計有兩種（i）由于鹽的滲析作用，引起細胞脫水，致使微生物活性部分喪失；（ii）在PCR技術中，CaCl₂是使細胞處于感受態的物質，這個時候微生物是zui脆弱的，很容易被外界的干擾破壞。

從表四可以看出，CaCl₂濃度對固定化細胞的機械強度影響較大。當CaCl₂濃度為2%~3%時，固定化顆粒在使用過程中會出現膨脹，甚至出現裂縫活破碎現象。因此，海藻酸鈣包埋法固定化細胞活性較高。

3.2 PVA—H₃BO₃包埋法

3.2.1原理

*是一種新型的微生物包埋固定化載體，它具有機械強度高，化學穩定性好，康微生物分解性能強，對微生物無毒，價格低廉等一系列優點，是一種具有實用潛力的包埋材料，近年來在國內外獲得了較廣泛的研究。

*（polyvinyl alcohol，簡稱PVA）的結構為：

 

    *在加熱后溶于水，在其水溶液中加入添加劑后發生凝膠化，或者在低溫下（-10℃）冷凍形成凝膠，從而將微生物包埋固定在凝膠網絡里。常用添加劑有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中加入硼酸活著硼砂，由于化學反應而形成凝膠。PVA于硼酸反應形成的凝膠為單二醇型，與硼砂反應形成的凝膠為雙二醇型，其結構式如圖1（略）。

 

PVA于硼砂反應形成凝膠時，成形困難，凝膠呈海綿狀結構，強度較低。但硼砂的用量較硼酸用量低得多，所以值的進一步研究。就目前的研究來看，大多采用H₃BO₃做交聯劑。

PVA—H₃BO₃包埋法是一種制備容易且價格低廉的固定化方法，其反應原理如圖2（略）。

利用該方法制得的凝膠顆粒機械強度高，使用壽命長且彈性好。

 3.2.2固定化方法

 以PVA為固定化載體，建立了利用PVA—H₃BO₃包埋固定化微生物細胞的方法，具體方法如下：

 方法I

①將*（PVA）加熱溶于水；

②將微生物細胞與PVA溶液混合均勻，使PVAzui終濃度為10%；

③將上述混合液滴入飽和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反應；

④濾出固定化顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

方法II

①將*（PVA）加熱溶于水,冷卻；

②將微生物細胞與PVA溶液混合均勻，使PVAzui終濃度為10%；

③將PVA與微生物細胞的混合液到入已滅菌的培養皿中，緩慢加入飽和硼酸溶液，浸泡10h；

④將凝膠切成3mm×3mm×3mm的小方塊，用生理鹽水洗凈，備用。

方法III

①將*（PVA）與海藻酸鈉加熱溶于水,冷卻；

②將微生物細胞與上述溶液混合均勻，使PVA與海藻酸鈉zui終濃度分別為7.5％～10%，0.4%～1.0%；

③將上述混合液用針形管滴入下列溶液中：

 H₃BO₃（飽和溶液） CaCl₂ 1.0％～5.0％  pH值4.0～7.0

④放置10h，使之充分反應；

⑤濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比較了固定化細胞的活性，結果如表五所示。

 

表五 PVA—H₃BO₃法固定化的比較

 

從表五可以看出，采用方法III，即改進的PVA—H₃BO₃法固定化細胞，其活性明顯提高，這是由于在方法III的固定化過程中，引入了少量的海藻酸鈉。海藻酸鈉作為一種多糖類天然高分子化合物，對微生物細胞器一定的保護作用，減輕了硼酸對微生物的毒性作用，因此提高了固定化細胞的相對活性。

3.2.3 PVA—H₃BO₃法中固定化試劑對細胞活性的影響

（1）    PVA對細胞活性的影響

   一般來說，PVA的濃度對微生物細胞活性的影響不大，即使高達10%時，對細胞活性也沒有明顯的不良影響。但是，PVA濃度增大，溶液的黏度隨之增大，使底物和產物的擴散，尤其是氧氣的傳遞受到影響，進而影響細胞活性。

（2）    H₃BO₃對細胞活性的影響

   硼酸的細胞毒性比較大，因而其對微生物細胞活性的影響是導致PVA—H₃BO₃包埋固定化細胞活性底的主要原因。

4、固定化細胞性能的評價

4.1固定化顆粒的密度

固定化顆粒是指一定體積內固定化顆粒的量， 因此，確定固定化顆粒的密度，也就是測定其體積和重量。但是由于固定化顆粒表面附著著一些水分，它不是固定化顆粒的組分，也無法通過過濾除去，可利用某些特殊溶劑（如葡萄糖）吸收，而這種溶劑不會擴散到固定化顆粒內，該溶劑被稀釋的量即為附著的水量。這樣，測定固定化顆粒的總量以及附著的水量即可通過計算的出其體積、密度和重量。具體方法此處不再詳細敘述。

4.2固定化顆粒的通透性和機械強度

    固定化顆粒的通透性，也稱為傳質性能，是用來衡量的固定化細胞與外界交換能力的重要指標。通透性越好，固定化細胞與外界的物質交換越容易，固定化微生物對于外界污染物的降解能力越強。

    機械強度，主要衡量固定化顆粒在外界的持續壓力沖擊下保持形狀的能力，一般來說，機械強度越大，顆粒可重復利用率越高，在工程上的應用價值越大。

    但是，通透性和機械強度是一對矛盾。在固定化過程中，固定化時間越長，顆粒的機械強度越大，但是通透性卻降低；反之，固定化時間越短，通透性提高，機械強度卻無法保證。因此，在實驗中應該綜合考慮兩個因素，在兩個指標中尋找*的組合。

4.3固定化顆粒的zui適溫度、zui適pH值

    固定化后的顆粒，由于在存在狀態上與游離的微生物不同，因此在zui適溫度和zui適pH值方面也會有很大的不同?？梢酝ㄟ^做對照試驗，測出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率，從而找出*的降解的溫度和pH值。

    同時可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴大。

4.4微生物的包埋量

    由于在制作固定化顆粒的過程中，不可避免的會有一部分微生物沒有包埋到顆粒之中，這部分微生物不會參加對污染物的降解，因而在一定程度上會影響降解的效果。 因此包埋量的測定也是評價固定化好壞的一個很重要的指標。

    微生物的包埋量可以通過菌落技術的方法加以測定。

5、固定化微生物的發展趨勢

    微生物在自然界中的物質轉化和環境凈化中起著非常重要的作用，微生物細胞是一個具有多種酶系統的統一體系，其本身就是一種天然的固定化酶反應器，因此利用固定化方法將微生物具體細胞加以固定，則可以用于催化一系列生理生化反應，固定化細胞內的酶體系十分穩定，且不影響其催化活性，具有造作和貯藏的良好穩定性。隨著科學技術，尤其是生物工程以及工藝學的發展，開發應用固定化技術處理廢水，已經引起國內外專家、學者的重視，并且逐步實現其在工業化生產實踐中的應用。

    固定化細胞技術易其*的優點在廢水生物處理領域受到廣泛關注，但是還有很多問題亟待解決，未來的主要研究方向主要集中于以下幾點：

（1）    固定化載體類型以及包埋方式的研究；

（2）    尋找、廉價、抗毒性強的微生物；

（3）    開發多種生物共生的固定化載體；

（4）    開發具有良好流態的固定化反應器；

（5）    協同固定化的研究。