目前zui常用的酶有*、蛋白酶K、*、*、無花果蛋白酶、*及尿素酶等，另外還有西瓜蛋白酶、蘋果蛋白酶和香蕉蛋白酶。其中*、蛋白酶K和無花果蛋白酶消化zui強烈，其次是*、*及*。各種消化酶的具體配制和使用情況如下。

 

    （一）消化酶的配制

 

    1．*

    *較常用，也較易控制，主要用于細胞內(nèi)抗原的檢測。使用的工作濃度一般為0．05％，-0.1％。

    配制方法：稱取0．05g或0．1g*和0．05g或0．1g無水氯化鈣，加入到100ml蒸餾水中，待溶解后用0．1mol／LNaOH調(diào)pH值至7．6。

    消化條件：37℃，10～40min，對某些陳舊的組織可適當延長消化時間。

    注意事項：該酶的*pH為7．6左右，在37℃、鈣離子激活的條件下活性*，必須新鮮配制。

 

    2．蛋白酶K

    該酶不僅可用于IHC的抗原暴露，而且常用于TUNEL末端檢測和原位雜交（1SH）

前的蛋白和DNA的分離。該酶的一般工作濃度是20ug／ml。

    配制方法：TE緩沖液（0．1mol／LTris—HCl，0．05mol／L EDTA，pH8．0），1ml：100ug／ml蛋白酶K，20。

    消化條件：37℃，消化20min左右。

    注意事項：蛋白酶K（proteinaseK）是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯白色念珠菌（Trititrachiumalbumlimber）類霉菌中純化得到。該酶有2個Ca²⁺結(jié)合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca²⁺，由于出現(xiàn)遠程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80％左右。因此，蛋白酶K的消化作用通常需加入EDTA。

 

    3．*

    常用工作濃度為o．4％。

    配制方法：0．01mol／L HCl，100ml；*（Sigma公司產(chǎn)品），400mg。

    消化條件：37℃，30～180min。

    主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示，另外還可以用于ISH前的消化。配制該酶還可以用0．1％檸檬酸。

 

    4．*

    *是從鏈球菌（streptomycesgriseas）中分離獲得的一種*蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物。貯存液濃度20mg／m1，-20℃保存。*反應(yīng)緩沖液為0．01mol／LTris—HCl（pH7．8），0.01mol／LEDTA和0．5％SDS。常用工作濃度lmg／m1，工作溫度37℃。

 

    5．無花果蛋白酶

    其工作濃度基本和*類似，溶在PBS（pH7．4）中即可用于消化，消化條件為37℃，30～60min。

 

    （二）消化酶的選擇

    在選擇用何種酶消化時，應(yīng)針對要顯示的抗原成分不同而選用不同的酶。一般*和*消化主要用于細胞間質(zhì)抗原的檢測，例如纖連蛋白（fibronectin）、層黏連蛋白（1aminin，LN）和各型膠原的顯示；其余酶消化均可用于細胞內(nèi)抗原的檢測。在配制蛋白酶時，應(yīng)考慮到酶的*pH。例如*的*pH為7．6，要在鈣離子的激活下于37℃才能達到*效率；而*則在酸性pH值下才能達到*效率。另外，經(jīng)酶消化后的切片應(yīng)充分洗滌，以去除殘留的消化酶，否則會對抗體或組織進行緩慢消化，影響抗原抗體的結(jié)合，破壞組織結(jié)構(gòu)。陽性和陰性對照片應(yīng)同時消化，避免人為差異。