這次和大家探討一些關于HPLC方法學開發(fā)的問題。當然，這是很久以前的思路，在今天看來是比較幼稚的，但是，如果能夠給大家一點哪怕一點點啟示也是好的。當然文章有很多缺陷，也希望大家批評。

液相色譜在極性的角度可以分成正相色譜分析和反相色譜分析。反相色譜分析一般使用水-甲醇-乙腈體系，一般選用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18鍵合相柱子。非極性物質一般用氯方-正己烷體系。因為qingqingcao沒有做過正相HPLC分離，所以，我們主要關注反相HPLC分析。

色譜柱的選擇

當然，選用的色譜柱一般就是C18柱。長度呢？如果分析的物質復雜，那么可以選取長一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。保證其分離度。 如果物質不是很復雜，那么選取150mm╳4.6mm╳5μm的色譜柱，可以有效地縮短分析時間。

檢測器的選擇

紫外檢測器是zui通用的檢測器之一，所以，本文均以紫外檢測器做說明。對于需要分析的物質，做全波長掃描，由于物質的不同官能團，他們會在不同的地方有吸收。通過綜合選取大家都有吸收的波長。選擇波長需要有權衡。同時也可以用一些特殊的波長，避免雜質的吸收，也可以提升測試準確度。或者使用雙波長的方法。

流動相的選擇

對于選取流動相，首先實驗一下樣品的溶解度。樣品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。如果，很容易溶解在水中，這就告訴我們，流動相選取，可能有機相要少些，比方說測試*，其極性很強，流動相中有機相比例不能多。（為了保護色譜柱，有機相比例一般不少于8% ）如果，樣品不太容易溶解在水中，那么有機相的比例應高些，比方像*，就可以用90% -95% 的甲醇體系。

其次是樣品的酸堿度。我們知道，C18色譜柱流動相pH在2-8 之間。太酸，太堿都可能損壞色譜柱。流動相pH值對于分離有一定作用，所以，酸性物質，一般流動相酸一些，堿性物質可能堿一些。

對于幾種物質的分離。如果不是太多的物質，用等度方法會比較好。流動相一般開始選用20mM磷酸緩沖鹽-乙腈體系。（pH一定，流速一定）。因為乙腈洗脫好，而且粘度低。通過水相-有機相的比例的改變，觀察各色譜峰的分離情況。這樣可以運用無限夾逼法找到zui合適的值。比方說，35：65（ACN：磷酸鹽）達到分離，但是還是有部分疊加，那么就微調即可。當然還要考慮到分析時間問題。不要為了*分離而犧牲了分析時間。所以，在色譜分析，有一個k值（容量因子）。κ∈（2，20）

如果真的無法改變，那么可以試著微調pH值，來分離。當然，由于乙腈毒性強，所以通過一定計算，用甲醇同等地接替乙腈。

如果有些物質很靠近死體積，那么需要考慮添加0.02mM離子對試劑，加強物質的保留能力。

流速

一般液相流速在0.8-1.4ml/min。shou選1.0ml/min

柱溫

柱溫不影響色譜的分離，但是，相對穩(wěn)定的溫度，可以使得保留時間穩(wěn)定。

進樣量

手動進樣，只有進樣環(huán)。一般也就是20μL。自動進樣的選擇很多。但是，zuihao不要超過80μL。因為進樣多，容易造成展寬。

分離物質的濃度

分離物質，不能夠太濃也不能太稀。太濃，容易過載；太稀檢測不出。具體還是根據(jù)檢測器的響應來調整。

小結

HPLC分析，首先要找到合適的流動相。流動相既要保證分離，又要關心分析時間。流動相盡量使用毒性小一點的甲醇。根據(jù)樣品和標準品的PH值進行調節(jié)流動相溶液酸堿度。

檢測波長很重要，要懂得合適的波長。也就是說，這個單一波長可以分析出所有需要分析的物質。可以通過波長的調整，規(guī)避雜質峰的干擾。

溫度和流速都對分離，影響不大。

分離條件摸索好后，就可以開展

1）線性濃度測試

2）精密度測試

3）樣品測試

4）回收率測試

5）空白測試。

6）zui小檢測限，zui小檢測量

定量的工作比較簡單，就是按照以上的思路去操作。那么一個項目就這么完成了。當然，這些需要我們的工程師們的努力和智慧。我希望寫的這些東西，能夠給初學者一點點啟示，當然，如果有錯誤的話，希望不會誤導大家。

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