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*、四環素、*多殘留分析的HPLC方法

2010年10月19日 09:23:30人氣:1875來源:上海銳谷生物科技有限公司

1.液相色譜法(HPLC)
(1)試劑和溶液
①*標準品
②四環素標準品
③*標準品
④乙腈(色譜純)
⑤甲醇(色譜純)
⑥三氯甲烷(分析純)
⑦正己烷(分析純)
⑧草酸(分析純)
⑨無水*(分析純)
⑩檸檬酸(分析純)
⑾EDTA-Naz(分析純)
⑿去離子水
⒀MckVaine緩沖液配制:pH 4.O
準確稱取無水*28.41g(12結晶水的則稱71.6gJ用水溶解并定容于1000ml容量瓶中,簡稱溶液A;準確稱取檸檬酸2L 00g溶于水中并定容于1000ml容量瓶中,簡稱溶液B。取625ml溶液A和1000mi溶液B混勻,調節pH值至4.0+0.05。
⒁MCI-Vaine-Na~EDTA提取液:準確稱取60、49g的EDTA—Na2,溶解于1625m1的MCI-Vaine緩沖液中,使成含O.0lmol/LEDTA-Naz的MCI-Vaine液。此溶液為提取液。
⒂0.01mol/L草酸溶液:稱取草酸L 26g,用水溶解定容于1000ml容量瓶中。
⒃0.01mol幾草酸甲醇溶液:稱取草酸L 26g,用甲醇溶解并稀釋至1000ml。
⒄標準貯備液:稱取*、四環素、*標準晶各o.1080g,用甲醇溶解并定容于lOOml棕色容量瓶中。為lmg/ml貯備液,一20~C保存,3個月有效。
⒅標準中間工作液:10(~g/mI,取ling/m1貯備液2.5ml,用甲醇稀釋并定容于25ml棕色容量瓶中。10t~g/m1,取10Cug/m1標準貯備液2.5ml,用甲醇稀釋并定容于25ml棕色容量瓶中。
⒆標準工作液:移取適量100~g/ml或10ug/ml標準中間工作液于10ml棕色容量瓶中,加6.0ml甲醇草酸液,并用水稀釋至刻度,搖勻。配制成濃度為0.05ug/m1、0.1ug/m1、0•3bg/ml、0.6ug/m1、1.2ug/ml、1.5ug/ml的系列工作液。需當日新配。
(2)測定步驟
①提取和凈化 稱取組織5.0g,加提取液15.0ml,三氯甲烷5ml,正己烷5nfl,勻漿邙外圍冰浴,于10000r/1min下勻漿30s。用5.0ml提取液洗刀頭。漿液轉入50ml離心管中,振蕩10min(稍微快些),于4000r/min離心10min,把提取液轉入第二個50ml離心管平。原勻漿杯用l0.0ml提取液洗,再轉人原50ml離心管中,洗殘渣,攪勻,振蕩5min,;300r/min離心5nfin,吸取提取液于第二個離心管中,合并二次提取液,于4000r/min離心mln,取上清液為樣液。
取一定體積的樣液過C18萃取柱0.6ml草酸甲醇,0.4ml水洗脫,進HPLC分析。
②測定
a.色譜條件
色譜柱:LUNA C18,5bm,250mmX4.6mm
保護柱:10GC4—ODS:C:s,SGE
柱溫;室溫
檢測波長:360nm
衰減:0.00UFS
流動相:0.01mol/L草酸液+乙腈+甲醇
流速:1.0ml/min.
進樣量;20uL
b.標準曲線的繪制 分別向液相色譜儀注入等體積的系列標準工作液,在上述色譜條件下檢測,記錄色譜峰面積。通過對藥物濃度—峰面積進行回歸分析,可獲得標準曲線回歸方程。
c樣液的測定 分析樣液按上述色譜條件供液相色譜儀分析。
③空白試驗 除不加試樣外,按上述測定步驟進行。
(3)靈敏度和回收率
本方法的檢測限為50ug/kg。
回收率為70.0%-98.2%。
 

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