江萊生物-中國老牌試劑供應商作者
克隆的道路有很多條,比如TA克隆、不依賴連接反應的克隆(LIC)、重組酶依賴的克隆等等。TA克隆和LIC都需要末端修飾,而這種修飾不容易被凝膠電泳等技術檢測。重組酶通常又是和克隆試劑盒捆綁銷售的,因此研究人員也很難優化重組反應。于是,美國艾默里大學生物化學系的Anton V. Bryksin和Ichiro Matsumura開發出一種PCR介導的克隆方法-重疊延伸PCR克隆(Overlap extension PCR cloning),相當簡單且可靠。
克隆過程如下:一開始用嵌合體引物進行PCR擴增,產生了線性的插入片段,且片段兩端都有載體序列。然后將載體和插入片段混合,變性并退火,隨后將載體作為模板,用Phusion DNA聚合酶延伸雜交后的插入片段,直到聚合酶到達插入片段的5’端。在幾輪PCR循環后,反應的終產物是帶有兩個缺口(每條鏈一個)的雙鏈融合質粒。利用DpnI限制性內切酶消化,除去母板質粒,新質粒則轉化到大腸桿菌中,DNA修復酶將缺口封住。
研究人員在反應中使用的是NEB公司的Phusion DNA聚合酶,他們認為這很關鍵,因為此酶保真度高,且不擁有鏈置換活性。研究人員還比較了五種不同的DNA聚合酶,認為這個。反應中只需要DNA聚合酶,而不再需要操作多個限制性內切酶、重組酶、連接酶和糖基化酶等。
在原理驗證的實驗中,研究人員首先克隆了gfp。他們認為,高濃度的插入片段和相對低的退火溫度(比計算出的退火溫度低5-10°C)對于的重疊延伸是很重要的。轉化后的重組子有98%以上呈綠色,說明克隆錯誤和原始載體的殘留極低。
研究人員還比較了PCR循環數對克隆效率的影響。他們發現:在zui初15個循環,重組克隆數量不斷增加,在17-18個循環達到高峰。之后的循環導致克隆數量略微下降。隨后,他們還比較了三種不同的載體:插入片段比例(1:5、1:50和1:250)。他們發現,1:250的比例產生了zui多的重組克隆。
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