兔核因子κB受體活化因子配基（RANKL）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：7.8 ng/ml - 500 ng/ml

zui低檢測限：1.95 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的兔RANKL，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定兔血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中RANKL含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗RANKL抗體的微孔中依次加入標本或標準品、*化的抗RANKL抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的RANKL呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。

2.         標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。

3.         樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

4.         *標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.         辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.         *標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7.         辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.         標準規(guī)格酶標儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         干凈的試管和Eppendof管

5.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為500 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制250 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）500 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

*標記抗體的稀釋原則：

臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl*標記抗體加990μl*標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液 100μl（取1μl*標記抗體加99μl*標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

4.         每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、*標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。

5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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