*膠囊為*代*類抗生素,臨床上常用于*敏感細菌所致的急性咽炎、急性扁桃體炎、中耳炎、支氣管炎、肺炎等呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮膚軟組織感染等。此類抗細菌藥品在進行微生物限度檢查時,需采用適宜的方法消除藥物抗菌活性的干擾,才能保證其檢驗方法的科學性及檢驗結果的準確性。
本試驗用2005年版中國藥典規定的3株細菌、2株真菌,采用不同的方法對3批*膠囊進行了微生物限度檢查方法的驗證試驗,以建立*膠囊的微生物限度檢查方法。
1、材料
1.1儀器：電子天平；臺式低速離心機；集菌儀。
1.2、培養基　營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基BL培養基、MUG培養基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
1.3　供試品：*膠囊批號為200609020060902、20060903）。
1.4菌種：大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、*LCMCC（B）26003]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]。
2、方法與結果
2.1菌液制備　將上述5株菌的新鮮培養物分別接種至規定培養基,細菌培養16h;酵母菌培養24h;霉菌培養5d,制備成菌孢子懸液,備用。
2.2供試液制備　按規定取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋包監緩沖液至100ml,在45℃水浴中保溫使囊殼溶解,混勻,即為1:10供試液;按規定取供試品10g采用無菌操作,將囊殼與內容物分離,稱量于同一容器中,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混合均勻,立即吸取混懸液置離心管中,500r•rmin-1離心4min,取上清液為1:10供試液。
2.3細菌、霉菌和酵母菌計數方法的驗證
2.3.1取供試液適量和50～100CFU試驗菌,分別注入同一平皿中,傾注相應瓊脂培養基后,培養計數,為試驗組;同法取試驗菌加入量,測定所加的試驗菌數,為菌液組;取供試液加入量測定供試品本底菌數,為供試品對照組;按以下公式:回收率%=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）÷菌液組平均菌落數]×100%計算回收率。
2.3.2　霉菌和酵母菌預試驗　取供試液①1，0.5mL分別注2皿為一組,每組加入1種真菌試驗菌菌液,共2組。1,0.50mL/皿2株菌回收率均為70%以上。
2.3.3　細菌預試驗
2.3.3.1　取供試液　①1；0.5；0.33；0.25；0.2；0.1mL分別注2皿為一組,每組加入1種細菌試驗菌菌液,共3組。3株菌回收率均為0%。
2.3.3.2　取供試液　②1；0.50；0.33；0,25；0.2；0,lmL分別注2皿為一組,每組加入1種細菌試驗菌菌液,共3組。3株菌回收率均為0%。
2.3.3.3　取供試液　②每10ml離心后的上清液全量加至裝有適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液容器中,采用薄膜過濾法,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗,在zui后一次沖洗液中分別加入50～100CFU試驗菌,取膜分別貼于營養瓊脂培養基上,培養計數,為試驗組,3株試驗細菌每膜沖洗200、300mL,其中300mL沖洗量的菌回收率可達70%以上;菌液組、供試品對照組同法測定。
2.3.3.4　稀釋劑對照組　取pH710無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量,共3份,分別加入3株試驗細菌菌液,使zui終菌濃度50～100CFU/mL,以下操作同2131313。
2.3.3.5　根據以上試驗結果,大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、*采用低速離心加薄膜過濾法,2株真菌采用常規法1mL•皿進行驗證試驗,