一、配料

      按培養基處方準確稱取各種成分，先在三角燒瓶中加入少量蒸餾水，再加入各種成分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水沖洗瓶壁。

二、溶化

      將各種成分混勻于水中，以流通蒸氣溶化半小時，如在電爐上溶化應隨時攪拌，如有瓊脂成分時更應注意防止外溢。溶化完畢，補足失去的水分。

三、矯正pH

    1.pH測定

     取與標準管同口徑的試管（通常用華氏試管）3支，于第1、3管各加入欲測定pH的的培養基5ml，并于*管中加入0.2g／L的酚紅0.25ml作為測定管，混勻；于第2管加入蒸餾水5ml，第4管為pH標準比色管。

    2.pH的校正

      若測定管過酸或過堿可用0.1mol／L氫氧化鈉或0.1mol／L鹽酸溶液矯正，直至顏色與標準管相同為止，加堿或加酸時要緩慢，每加1滴后要充分混勻，比色后再加第2滴（有時僅加半滴）準確記錄加入的量。

     3.計算

     設5ml培養基矯正pH至7.4時需0.1mol／L氫氧化鈉0.15ml，現有培養基4990ml，需加氫氧化鈉的量可按下列方法計算：5∶4990＝0.15∶X

X＝0.15×4990/5＝149.7（ml）

如將此0.1mol／L的氫氧化鈉改用1mol／L的氫氧化鈉時，則需14.9ml即可醫學教育網搜集|整理。

四、過濾澄清

    培養基配制后一般都有沉渣或混濁出現，需過濾成清晰透明后方可使用，常用的過濾方法如下：

     1.液體培養基

      液體培養基必須清晰，以便觀察細菌的生長情況，常用濾紙過濾，亦可在加熱前加入用水稀釋的雞蛋白（1000ml培養基用1個雞蛋白）在100℃加熱后保持60～70℃,40～60分鐘，使其不溶性物質附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以濾紙過濾。

    2.固體培養基

     如系瓊脂培養基，于加熱融化后需趁熱以絨布或兩層紗布中夾脫脂棉過濾；亦可用自然沉淀法，即將瓊脂培養基盛人鋁鍋或廣口搪瓷容器內，以高壓（103.43kPa）蒸汽融化15分鐘后，靜置高壓鍋內過夜，次日將瓊脂傾出，用刀將底部沉渣切去，再融化即可收清晰的瓊脂培養基。

五、分裝

     1.根據需要將培養基分裝于不同容量的三角燒瓶、試管中。分裝的量不宜超過容器的2／3以免滅菌時外溢。

     2.瓊脂斜面分裝量為試管容量的1／5，滅菌后須趁熱放置成斜面，斜面長約為試管長的2／3.

    3.半固體培養基分裝量約為試管長的1／3，滅菌后直立凝固待用。

     4.高層瓊脂分裝量約為試管的1／3，滅菌后趁熱直立，待冷后凝固待用。

     5.液體培養基分裝于試管中，約是試管長度的1／3.

     6.瓊脂平板：將滅菌（或加熱融化）后的培養基冷至50℃左右，以無菌手續傾人滅菌平皿內，內徑9cm的平皿傾注培養基約13～15ml，輕搖平皿底，使培養基平鋪于平皿底部，待凝固后即成，傾注培養基時，切勿將皿蓋全部啟開，以免空氣中塵埃及細菌落入。

     新制成的平板培養基（簡稱平板），表面水分較多，不利于細菌的分離，通常應將平皿倒扣擱置于37℃培養箱內約30分鐘待平板平面干燥后使用。

六、滅菌

    不同成分、性質的培養基，可采用不同的滅菌方法。高壓蒸汽滅菌法：高壓滅菌的溫度與時間隨培養基的種類及數量的不同有所差別，

      一般培養基少量分裝時高壓（103.43kPa）滅菌15分鐘即可，培養基分裝量較大時，可高壓（103.43kPa）滅菌30分鐘，含糖的培養基高壓（55.16kPa）滅菌15分鐘。以免糖類被破壞。

七、檢定

     每批培養基制成后須經檢定方可使用，檢定時將培養基放37℃溫箱內培養24小時后，證明無菌，同時用已知菌種檢查在此培養基上生長繁殖及生化反應情況，符合要求者方可使用。

八、保存

    制好的培養基，不宜保存過久，以少量勤做為宜。每批應注明名稱，分裝量，制作日期等，放在4℃冰箱內備用。