一、實驗原理：

1. 細胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的 DNA 和 RNA 出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般認為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA 呈藍綠色，呱咯寧染低聚分子的 RNA 呈紅色。由此對細胞中的 DNA 和 RNA 進行定位、定性、和定量分析。

2. 由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團的數(shù)目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理條件下，整個蛋白質(zhì)所帶負電荷多，則為酸性蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用不同 pH 值的固綠染液分別染色，細胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。

3. 過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細胞內(nèi)的過氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍色的聯(lián)苯胺藍，進而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定過氧化物酶的有無或多少。

4. 組織、細胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法來顯示，其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過碘酸的氧化作用，打開碳鏈形成醛，生成的醛基與 Schiff 試劑中的無色品紅反應(yīng)形成紫紅色化合物。

二、實驗需用試劑：

PBS 緩沖液（pH7.2）

甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液

純丙酮

l/2 丙酮 1/2 二甲苯

純二甲苯

70％乙醇

5％三氯醋酸

0.1％堿性固綠

0.1％酸性固綠

0.5％硫酸銅

聯(lián)苯胺混合液

1％番紅

無水乙醇

過碘酸酒精液

Schiff 氏酒精液

亞硫酸水

Ehrlieh

蘇木精

95％乙醇

Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1，體積比）

三、實驗設(shè)備

光學(xué)顯微鏡

解剖器材

蠟盤

載玻片

吸水紙

染色缸

蓋玻片

水浴箱

實驗材料

蟾蜍、小白鼠各一只

肝臟石臘切片

培養(yǎng)的 Hela 細胞

四、實驗步驟

1. Brachet 反應(yīng)一顯示細胞內(nèi)的 DNA 和 RNA

   （1） 接種 Hela 細胞于蓋片上并培養(yǎng) 24～48 小時，使長成單層；

   （2） 取出蓋片，用 PBS（pH7.2）輕輕沖洗蓋片表面去除殘渣；

   （3） 放入 Carnoy 固定液中固定 l 小時；

   （4） 浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色；

   （5） 取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 2～3 次（2～3 秒鐘左右），吸去水分。放入純丙酮中分色 2～3 秒鐘；

   （6） 放入 l／2 丙酮 1／2 二甲苯中 5 秒鐘；

   （7） 放入純二甲苯中透明 5 分鐘；

   （8） 滴一滴中性樹膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片；

   （9） 鏡下觀察。

2. 細胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示

   （1） 以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。小心將心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫晾干；

   （2） 將涂片作好標(biāo)記放在 70％乙醇中固定 5 分鐘，室溫晾干；

   （3） 放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分鐘，抽提出核酸；

   （4） 清水沖洗多次（3 分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸；

   （5） 濾紙吸干玻片上水分；

   （6） 一張片放入 0.1％堿性固綠（pH8.0～8.5）中染色 10～15 分鐘,另一張片放入 0.1％酸性固綠（pH2.0～2.5）染色 5～10 分鐘；

   （7） 清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。

3. 細胞內(nèi)過氧化物酶的顯示

   （1） 取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜向剪斷，用 PBS 緩沖液濕潤過的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上；

   （2） 推片，室溫晾干；

   （3） 將涂片放入 0.5％硫酸銅中浸 30 秒~1 分鐘；

   （4） 取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng) 6 分鐘；

   （5） 清水沖洗，放入 1％番紅溶液中復(fù)染 2 分鐘；

   （6） 清水沖洗，室溫晾干；

   （7） 鏡檢或封片后鏡檢。

4. 過碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）——顯示細胞內(nèi)糖原

   （1） 取 l~2mm 厚的肝組織塊，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小時；

   （2） 乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片；

   （3） 用 70％乙醇展片；

   （4） 脫蠟：二甲苯（1）5 分鐘→二甲苯（2）5 分鐘→100％乙醇 5 分鐘→含 1％火棉膠的乙醇液 1 分鐘→70％乙醇 1 分鐘；

   （5） 直接浸入過碘酸酒精液反應(yīng) 5～15 分鐘，經(jīng) 70％乙醇洗片刻；

   （6） 浸入 Schiff 氏酒精液反應(yīng) 15 分鐘；

   （7） 亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴散的染料；

   （8） 流水沖洗 3～5 分鐘；

   （9） 蒸餾水洗；

   （10） 浸入 Ehrlich 蘇木精復(fù)染 20~30 秒，使細胞核著色；

   （11） 脫水：95％乙醇 3 分鐘二次→100％乙醇 3 分鐘二次→二甲苯透明 10 分鐘二次；

   （12） 加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。