實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

 一、 樣品準備

1． 準備好 25cm2細胞培養瓶或 60mm細胞培養皿的待測培養細胞（5 X 106細胞）

2． 小心加入 xx 毫升預冷的 SBJ 清理液（試劑 A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞

5． 加入 xx 毫升 SBJ 清理液（試劑 A），混勻細胞

6． 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入 xx 微升S B J   裂解液（試劑 B），充分混勻

10．轉移到預冷的 1.5 毫升離心管

11．強力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管

  15．移取 2  微升進行蛋白定量測定

16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 660nm，并置零

3． 準備好 5 個 1.5 毫升離心管，標記為 1 至 5 號管

4． 按下表分別加入S B J   陰性液（試劑 D）和 SBJ標準液（試劑 H）到每個離心管， 混勻

 5． 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表：

三、 標準曲線測定

1． 移取 xx 微升 SBJ 陰性液（試劑 D）到新的比色皿

2． 加入 5 微升上述配制的標準液

3． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ終止液（試劑 F），混勻

5． 加入 xx 微升 SBJ 顯色液（試劑 G），混勻

6． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

7． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

8． 重復實驗步驟 1 至 7 四次

9． 構建標準曲線：縱座標（Y 軸）為吸光單位（A）；橫座標（X 軸）為標準磷濃度

    （微摩爾/升）

四、 樣品背景測定

   1． 移取 xx 微升S B J 緩沖液（試劑 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待測樣品（總量 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ 終止液（試劑 F），混勻

5． 加入 xx 微升 SBJ 顯色液（試劑 G），混勻

6． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

7． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

8． 根據標準曲線獲得樣品背景對應     磷濃度

五、 樣品活性測定

1． 移取 xx 微升 SBJ緩沖液（試劑 C）到新的比色皿

2． 加入 5 微升待測樣品（總量 100 微克細胞裂解萃取液蛋白）

3． 在 37℃溫度下孵育 2 分鐘

4． 加入 xx 微升 SBJ 反應液（試劑 E）

5． 在 37℃溫度下孵育 10 分鐘

6． 加入 xx 微升 SBJ 終止液（試劑 F），混勻

7． 加入 xx 微升SBJ顯色液（試劑 G），混勻

8． 室溫下靜置 15 分鐘，避免光照

9． 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數

10．根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度

 {[根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度（微摩爾/升）—根據標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度（微摩爾/

升）]X 5（體系倍數）X 樣品稀釋倍數}÷ 10（反應時間；分鐘）＝納摩爾磷/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度） 毫克/毫升＝納摩爾磷/毫克/分鐘

注意事項

1． 本產品為 25 次操作，包括 5 次標準測定

2． 操作時，避免污染母液

3． 操作時，須戴手套

4． SBJ終止液（試劑 F）和S B J 顯色液（試劑 G）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

5． 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理

6． 比色測定后，比色皿須清洗*

7． 如果用戶沒有 660nm 波長，可以使用 600 至 660nm 的任一波長替代

8． 顯示綠色表明具有較強酶活性

9． 空白對照讀數應小于 0.2

10．建議待測樣本蛋白濃度為 100 微克/5 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；

11．鈣調神經磷酸酶活性單位濃度定義：在 37℃溫度下，pH 8.0 的情況下，每單位酶在單位時間內（每分 鐘）釋放 1 微摩爾的磷

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確