重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進(jìn)行鑒定，也可以利用擴(kuò)增引物通過 PCR 進(jìn)行鑒定，陽 性重組子能切出所需要的片段或得到相應(yīng)片段的 PCR 產(chǎn)物。
1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于 2ml 含適當(dāng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基中，37℃搖 床培養(yǎng)過夜。
2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13,000rpm×3min 離心，棄上清，加入 20μl ddH2 O 和
20μl 酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min 離心。
3. 取上清進(jìn)行瓊脂糖電泳，加入載體質(zhì)粒 DNA 作為陰性對(duì)照，根據(jù)質(zhì)粒大小 初步篩選重組子，重組子的泳動(dòng)速度應(yīng)該慢于載體質(zhì)粒。
4. 用堿法小量制備可能是重組子的質(zhì)粒 DNA。
5. 選取適當(dāng)?shù)拿福瑢?duì)重組子進(jìn)行酶切分析，酶切體積均為 10μl 體系。酶切樣品 進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。
6. 酶切析正確的重組子分成兩份，一份進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，另外一份保種。
7. 若用 PCR 法鑒定，則在第 2 步時(shí)每個(gè)樣本取 0.5-1.0μl 菌液為模板進(jìn)行 PCR
反應(yīng)，每管反應(yīng)體系z(mì)ui低可少至 10μl ，PCR 產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣 本進(jìn)一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測(cè)序。